07生物素-亲和素教案.ppt

免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。 PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。 1. 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物； 2. 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物； 3. 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA； 4. PCR扩增生物素化DNA部分。 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR产物每轮循环增加一倍 免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的还不多； 实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。 在报道的文献中均采用待检抗原直接吸附固相，这样固相的均质性必然对结果有很大的影响；同时检测的样品液中其它成分也可以吸咐固相，极易产生背景过高或精确度下降。 如用微量板作为固相需选用配套的PCR仪，否则需将其移入反应管内，这必然导致很大的误差，经放大可产生显著差异。 * * * 概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质。 优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此与聚苯乙稀的非特异性吸附远低于亲和素，因此应用广泛。 结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙氨酸含量较大 。 特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分子。 分子量：65000 亲和常数：1015/mol 结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基 PI 10.5 6 结合位 色氨酸 色氨酸 生物素 4 4 Ka 1015 1015 活性 13～15U 15～18U 亲合素（AV） 链霉亲合素(SA) SA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于AV，因此目前以SA标记的酶结合物更为常用。 亲合素(Avidin, AV) 亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素 生物素（Biotin, B） 亲和素的标记： HRP(过氧化酶)的标记 标记物： 小分子物质：示踪物125I、胶体金、异硫氰酸荧光素(FITC) 、化学发光物 大分子物质：如酶、抗原、抗体、铁蛋白 改良过碘酸钠法 戊二醛法 链霉亲和素的标记 方法：过碘酸钠法 HRP+NaIO4+SA 透析+KBH4 沉淀 O O O O O O NaIO4 + NH2Avidin O O OH OH N Avidin H2O O O OH O O O N Avidin N Avdin NaBH4 Schiff碱 酶-五炭糖环 酶－NH2 亲和素－NH2 ＋ (CH2)3 C H O C H O (CH2)3 CH N 酶 CH N 亲和素 O O O O O O NaIO4 O O OH OH + NH2SAvidin N SAvidin H2O O O OH O O O N SAvidin N Avdin KBH4 Schiff碱 酶-五炭糖环 生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强 生物素与亲合素各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性 使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献 灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此，BAS具有多级放大作用，反应的灵敏度高。 稳定性高和特异性强：AV/SA与生物素结合的亲和常数比抗原-抗体反应至少高1万倍，二者的结合呈高度专一性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，BAS稳定性高，特异性强。 适用性广泛：BAS的多级放大作用，以及既可 偶联生物大分子，又可连接标记