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显性标记在广两优476种子纯度鉴定中的应用 　　摘要：广两优476是广占63-4S和R476配组而成的两系中籼新组合，其父本R476是利用分子标记辅助选择技术育成的含有抗褐飞虱基因Bph14的恢复系。根据水稻抗褐飞虱基因Bph14的序列设计显性标记76-3用于鉴定广两优476的种子纯度。结果表明，用显性标记鉴定两系杂交稻的种子纯度，方法简单、结果可靠。 　　关键词：显性标记；广两优476；纯度鉴定 　　中图分类号：S339.3；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5884-03 　　广两优476是利用不育系广占63-4S和恢复系R476配组育成的两系中籼新组合，具有产量高、品质优和熟期适宜等特点，并于2010年3月通过了湖北省农作物品种审定委员会的审定[1]。2011-2013年，广两优476连续3年被湖北省农业厅确定为水稻主导品种之一，正在生产上大面积推广应用。 　　由于光温敏不育系在自然环境条件下易受到光温等条件的影响，因此在制种期间若出现异常低温可能引起不育系育性波动，导致不育系部分自交结实从而影响杂交种子的纯度；另外，由于制种时隔离不严，或收获、装运等环节人为因素的影响，也可能造成串粉混杂或机械混杂。因此，探索一种简单、准确、快速地鉴定两系杂交稻种子纯度的方法是保证两系杂交稻安全推广应用的关键环节。 　　分子标记鉴定杂交水稻种子纯度已有不少报道[2-4]，但大多是利用共显性SSR标记，由于SSR标记往往在亲本间差异较小，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或高分辨率的琼脂糖凝胶电泳才能区分。这就增加了分子检测的难度和鉴定成本，而一般的显性标记对于某一个品种来讲由于特异性不强而无法使用。抗褐飞虱基因Bph14来自于野生稻，已经被定位[5]和克隆[6]，与其紧密连锁的分子标记MRG2329也已经成功应用于分子标记辅助育种中，通过分子标记辅助选择鉴定了育成的恢复系R476及其杂交组合广两优476带有抗褐飞虱基因Bph14[7，8]。本研究针对杂交组合广两优476，利用Bph14基因特异的显性标记76-3对种子纯度鉴定的方法进行了研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　不育系广占63-4S、恢复系R476和广两优476种子采自湖北鄂科华泰种业股份有限公司制种基地。不同制种田收获的种子编号后随机抽样分成2份，一份在海南省进行田间种植鉴定，设计3次重复，每重复单本种植500苗；另一份取200粒种子浸种催芽后放置培养箱中生长，1周后取单株叶片，采用CTAB法[9]从叶片中提取DNA，利用显性标记76-3鉴定种子纯度。 　　1.2 试剂 　　Taq酶、dNTPs、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖等均购自宝生物工程（大连）有限公司；MRG2329引物序列由武汉大学何光存教授提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。 　　1.3 PCR扩增 　　PCR反应体系为：1.5 μL 10×PCR Buffer （100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，pH 8.3），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.6 μL 上、下游引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），1.0 μL 模板DNA，补ddH2O至15 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s，退火 30 s（MRG2329的退火温度为60 ℃，76-3的退火温度为58 ℃），72 ℃延伸1 min，35个循环； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用。MRG2329的PCR扩增产物用0.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测[7]，76-3的PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。 　　2 结果与分析 　　2.1 分子标记MRG2329和76-3在广两优476亲本及杂交种中的多态性 　　MRG2329为共显性标记，PCR扩增产物片段大小为180 bp，由于亲本间差异较小，需使用聚丙烯酰胺凝胶电泳才能分辨，电泳结果见图1a。含Bph14基因的恢复系R476片段稍大，不育系广占63-4S的片段较小，杂交种广两优476为杂合带，利用MRG2329扩增片段大小的差异能将恢复系、不育系和杂交种区分。76-3为显性标记，PCR扩增产物片段大小为570 bp，电泳结果见图1b。含Bph14基因的恢复系R476和杂交种广两优476有扩增产物，不育系广占63-4S无扩增产物，利用扩增产物的有无能将杂交种和不育系区分，因此用显性标记76-3可以检测出杂交种中混杂的不育系种子。 　　2.2 利用显性标记76-3鉴定杂交水稻广两优476种子的纯度 　　为了便于操作，每组样品随机提取94个单样