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实验七 发酵菌株的初筛 石陆娥 shilue@126.com 实验目的 从已分离得到的乳酸菌中筛选出能够产生抑菌活性物质的菌株。 实验原理 抑菌活性物质是生物（特别是微生物）在生命活动过程中所产生的一类代谢产物。乳酸菌是具有抑菌活性的，其主要原因是有机酸（如乳酸）的产生，另外，它还能够产生其他抑菌活性物质，比如过氧化氢、细菌素和类细菌素等，这些物质都可以对腐败微生物或致病微生物产生抑制，甚至杀死的作用。在抑菌活性物质产生菌的筛选过程中，常以发酵产物对指示菌产生抑菌圈的大小来衡量抑菌作用的强弱和抑菌活性物质的有效浓度。 实验器材与试剂 1.菌株 实验六所分离得到的乳酸菌株。 指示菌为金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌。 2.培养基 LB培养基和MRS培养基。 3.器材与试剂 高压蒸汽灭菌锅、恒温干热灭菌箱、超净工作台、天平、电炉、1mol/L HCL、1mol/LNaOH、pH试纸、搪瓷杯、量筒、三角瓶、玻璃珠、试管、培养皿、吸管、移液管、标签等 实验步骤 抑菌活性物质产生菌的初筛 1.指示菌培养基的配制与灭菌 按照配方配制LB培养基1000ml，分装到10个250ml的三角瓶中，每瓶100ml，透气膜绑好瓶口，121℃灭菌20min。 2.指示菌平板的制备 本实验选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌分别作为革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌和含芽孢细菌的指示菌。 待灭完菌的LB培养基冷却到50℃时，以无菌操作法挑取2-3环指示菌的菌苔，至LB培养基中，摇匀后倒平板。 3.抑菌实验 3.1 琼脂块法 将分离所得的乳酸菌在MRS培养基中进行平板划线，置于37℃培养箱中培养24h； 用无菌打孔器在长满菌苔的培养皿中无菌操作垂直钻取连有培养基的菌块，用灭菌镊子将菌块移至指示菌平板上，做好相应的标记（写上菌名、接种日期、接种人等）。 将平板正放在37℃恒温箱中培养24h，观察菌块周围透明圈（抑菌圈）的大小。透明圈越大，表示抑菌能力越强。 3.2滤纸片法 挑取2-3环筛选得到的乳酸菌菌苔，接入装有10mLMRS培养基（不加琼脂）的试管中，37℃摇床（200r/min）培养，培养24h。 用滤纸片蘸取发酵液，贴在指示菌平板上，37℃恒温箱培养24h后观察滤纸片周围抑菌圈的大小。 3.3 牛津杯法（重点） 注意事项 指示菌最好用致病微生物，但对普通实验室来说，用致病微生物作指示菌很不安全。本实验选用了不同类型的非致病微生物作为指示菌，但操作时仍应该严格遵循无菌操作规程，防止菌液污染环境。 思考题 查阅资料，设计一个实验来筛选蛋白酶产生菌。 影响抑菌圈大小的因素有哪些？ * 挑取2-3环筛选得到的乳酸菌菌苔，接入装有10mLMRS培养基（不加琼脂）的试管中，37℃摇床（200r/min）培养，培养24h。 指示菌平板制备：待灭完菌的LB培养基冷却到50℃时，以无菌操作法挑取2-3环指示菌的菌苔，至LB培养基中，摇匀后倒平板。 在指示菌平板上做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），用无菌镊子将无菌的牛津杯轻轻放入指示菌平板中，在水平放置的平板中均匀地放置2只牛津杯。 用微量移液器吸取发酵液100ul 至牛津杯中，注意不要将发酵液溢出牛津杯外。 将加入发酵液的平板放置4℃冰箱扩散4-5h，然后于37℃恒温培养箱中培养24h，24h后观察牛津杯周围抑菌圈的大小。