辣根过氧化物酶的提取、纯化以及应用详细分析.ppt

辣根过氧化物酶的提取、纯化以及应用 辣根过氧化物酶简介 辣根，是十字花科多年生直立草本植物，在世界大部分温和地区都有种植。它的根不但可以烹调，同时还含有一种含量丰富的过氧化物酶，这些同工酶统称为“辣根过氧化物酶 HRP ”。 其中含量最为丰富的是辣根过氧化物酶同工酶 C HRP C 现在HRP C的结构与作用机制已经被阐明 结构 反应机理 分离纯化 特性分析 应用 HRP的结构 辣根过氧化物酶同工酶 C是一条由 308个氨基酸组成的肽链 。在这条肽链中有 4个由两分子半胱氨酸组成的二硫键 ,它们分别是 11～91、 44～49、 97～301和 17～209;同时还存在一个由 Asp99和 Arg123组成的盐桥。 HRP的结构 HRP C含有两个不同的金属中心:正铁原卟啉 即血红素 和两个钙原子。这两个金属中心对酶的整体结构和功能都是非常重要的。 通过血红素中铁原子的一个轴向结合点与肽链上 His170侧链的 N原子结合 ,使血红素垂直连接在 His170上 下图 ;而卟啉铁的另一个轴向结合点在静态酶中则是空着的 ,当有 H2O2 存在时 ,该结合点就能与 CO、 氰化物、 氟化物或叠氮化物等小分子结合。 HRP的结构 酶的结构总体上看来大部分是α螺旋 ,但其中也包含一些小的 β折叠。 在血红素平面上下两侧存在着两个空白区域 ,该区域可能是由钙结合位点与其他结构元素共同作用而成的 ,也可能是基因复制后留下的产物。 HRP的结构 在血红素平面的上下两侧存在着两个钙原子的结合位点 ,它们通过一个氢键群与血红素结合区域相连。 每个钙原子都是 7供氧配合体 ,它们能同时与主肽链上含羰基的氨基酸 ,侧链上的 Asp、Ser和 Thr,以及一个末端结构水分子结合。 钙离子的丢失将会导致 HRP C酶失活和热稳定性的下降,还能使血红素的构型发生改变。 HRP的作用机制 由 HRP催化的多数反应可由以下等式表示 ： AH +H2O2 →· A + 2H2O 其中 AH是还原性底物 , · A是自由基。还原性底物包括芳香族化合物 ,酚类化合物 ,吲哚 ,胺类和磺酸盐。 催化循环的第一步是 H2O2 和静态酶中的 Fe Ⅲ 反应生成化合物 Ⅰ HRPⅠ , HRPⅠ是一个高氧化态的催化中间体 ,包含一个含氧 Fe Ⅳ 中心和一个带正电荷的卟啉。 由一分子还原性底物的加入HRPⅠ ,生成另一个含有含氧 Fe Ⅳ 中心的催化中间体HRPⅡ。 由一分子还原性底物参加HRPⅡ ,使 HRPⅡ还原成静态酶。 图中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂的反应 ,包括形成二倍体、 三倍体、 多聚体 ,以及启动一个以该产物为底物的反应。 辣根过氧化物酶的分离纯化 辣根过氧化物酶的分离纯化 　pH对 HRP活力的影响 在不同的酸度条件下 ,分别测定辣根过氧化物酶 HRP 催化 H2O2氧化 OPD的初始反应速率 dA /dt ,以 dA /dt对 pH值做图 发现 ,在 pH值 4 . 5～4 . 75范围内 , HRP活力呈上升趋势 ,至 pH值为 4 . 75时 HRP活力达到最大.以后随着 pH值的增高 ,其活力呈下降的趋势. HRP催化 H2O2氧化 OPD体系的最适 pH为 4 . 75 . 　pH对 HRP稳定性的影响 HRP分别在 pH2 . 5～5溶液中保纯 7天后 , HRP催化反应速率为 0,说明 HRP在该条件下保纯 7天后已完全失活.在 pH6 . 0～8 . 0范围内 , HRP催化反应的初始速率随 pH值的增加而逐渐增大.当 pH值达到 8 . 0以后反应速率趋于稳定 ,说明 HRP在偏碱性缓冲液中的稳定性较高 ,而在酸性条件下 HRP容易失活 ,其原因可能是由于在碱性条件下酶的结构相对稳定 ,酶活性处于休眠状态 辣根过氧化物酶应用 酚类化合物是常见的有毒有机污染物 ,含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一 ,它的大量排放对水体、土壤造成严重的污染 ,进而危害人类的健康。 HRP在 H2O2存在时能催化苯酚、 苯胺及其取代物聚合。 张国平等人对用辣根过氧化物酶处理废水中的五氯酚进行了研究 　 pH值对去除率的影响 在pH 2～8 的范围内测定了五氯酚在辣根过氧化物酶和 H2O2 的作用下的去除率。实验结果见左图。由图可见 ,在 pH 值为 4 和 5 时 ,去除率达95 %以上 ,为最佳 pH 范围。 　H2O2 对去除率的影响 采用不同的 H2O2 用量与 0.05mmol/ L 五氯酚进行实验 辣根过氧化物酶是过量的 ,测定五氯酚的去除率 ,结果见左图 。当 H2O2 用量为 0～0.025mmol/ L 时 ,五氯酚去除率按比例上升 也即残余五氯酚浓度按比例