实验九绿色荧光蛋白在培养的动物细胞中表达.pptVIP

脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25~1000nm不等。 阳离子型脂质体与外源DNA混合，DNA带有负电荷，与阳离子型脂质体通过静电吸引形成DNA－脂质体复合物。这种复合物可再与细胞膜上带负电荷的唾液酸残基结合，或通过胞吞作用将质粒带入细胞内。 脂质体介导法 磷酸钙沉淀法 核酸与磷酸钙以共沉淀颗粒形式加入细胞培养液中，细胞显著增加摄取核酸的能力，机制不明。 影响转染效率的因素：较高浓度DNA 10~50ug 、沉淀停留在细胞的时间、甘油和DMSO的冲击、冲击时间。 DEAE-葡聚糖转染法 DEAE-葡聚糖是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA。 方法简单、重复性高、特别适用于研究基因瞬时表达（transient expression）。 电穿孔法 电穿孔（electroporation）是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的空洞，从而促进细胞吸收外界的DNA分子。 电穿孔仪和杯 基因枪轰击法 在真空状态下，利用粒子加速器将外面包裹了外源DNA的金颗粒或钨粉颗粒进行加速，打入完整的细胞中，从而实现外源基因的表达。 基因枪系统和便携式基因枪 病毒载体导入细胞的方法： 生物法：病毒自身与宿主细胞表面的特异性受体相互作用而感染宿主细胞。 化学法：DEAE-葡聚糖法、脂质体法、磷酸钙法等。 3. 报告基因的表达与检测 将目的基因克隆入含有报告基因的载体上。通过报告基因的表达间接检测目的基因的表达情况、对细胞的影响和定位。 将所要分析的启动子与报告基因构建，通过报告基因的表达情况分析启动子的强弱。 报告基因作为阳性对照。 选择报告基因的原则： 报告蛋白应不存在于宿主中。 有一个简单、快捷、灵敏及经济的检测报告蛋白的方法。 报告蛋白的分析结果应具有很宽的线性范围，免于分析启动子活性的变化。 报告基因的表达不影响受体细胞的生理活动。 常见的报告基因： 半乳糖苷酶基因。 氯霉素乙酰转移酶基因。 荧光素酶基因。 人生长素基因。 分泌型碱性磷酸酶基因。 绿色荧光蛋白基因。 β-葡萄糖醛酸酶基因。 绿色荧光蛋白基因 绿色荧光蛋白 green fluorescent protein， GFP ，最早是在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。由于具有自发荧光等特性，在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。 GFP标记的微管 GFP在植物研究中的应用 GFP在培养的细胞中表达 GFP改造的蜜蜂 GFP转基因动物 4. 外源基因的瞬时和稳定表达 瞬时表达：质粒或病毒转染入细胞后，利用宿主细胞的转录体系和翻译体系进行即时表达，表达可持续1~4天。 稳定表达：质粒或病毒载体将目的基因随即整合到宿主基因组中，通过目的基因上所带的抗性基因进行筛选，只有基因组中含有目的基因的细胞才能存活，从而产生在一定的抗性环境下，稳定转染的细胞系。 维持稳定转染细胞系的常用选择标记 氨基糖苷磷酸转移酶（标记：neo，药物： G418） 二氢叶酸还原酶（标记：DHFR，药物MTX氨甲喋呤） 潮霉素B磷酸转移酶（标记：HPH，药物：潮霉素B） 胸苷激酶（标记：TK，药物：HAT培养液） 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（标记：XGPRT，药物：黄嘌呤、次黄嘌呤、胸苷、氨氨基蝶呤等） 腺苷脱氨酶（标记：ADA，药物：胸苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、脱氧肋间型霉素、呋喃木糖苷） 五.外源基因在动物细胞表达 实验方法Video 可见光下的CHO细胞（200倍） 荧光下的CHO细胞（200倍） merge 可见光下的CHO细胞（400倍） 荧光下的CHO细胞（400倍） merge 实验报告书写要求： 实验原理：细胞培养、转染 实验方法：查阅相关书籍和网页，详细总结细胞传代培养的实验流程和脂质体转染的实验流程。 3. 回答问题： （1）若在细胞培养的过程中，细胞培养皿/瓶中出现细菌污染，该如何操作？如何判断污染源？ （2）脂质体介导法转染细胞的过程中，有哪些因素会影响转染的效率？如何提高转染效率？ （3）若给你一株从你未培养过的细胞株，你应该怎样做才能顺利的将该细胞株顺利传代培养？ * * ≤≤ 培养液（基） 1 天然培养基 血清、水解乳蛋白、组织提取液 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 新生牛血清（newborn calf serum，NCS） 成年牛血清、马血清、羊血清、兔血清等 Invitrogen co.（GIBCO HyClone co. 经严格检验：无细菌、支原