槲皮素,铜离子葡萄糖苷酶的抑制作用.doc

槲皮素，铜离子对(-葡萄糖苷酶的抑制作用研究 一、实验原理 (-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一类能够从含有(葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解(葡萄糖基的酶的总称包括麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶等(-D-葡萄糖苷(-葡萄糖苷酶-葡萄糖苷酶的活性可以达到治疗某些疾病的目的，研究最为成熟的是治疗Ⅱ型糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 虽然苯并咪唑衍生物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性鲜有报道，但α-葡萄糖苷酶抑制剂的种类繁多，如多糖类（包括多糖、纤维素、果胶、寡糖等）、黄酮类、生物碱类、皂苷类等。应用于临床的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要是：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇（图1）。当前，为了寻找抑制活性更强、副作用更低以及合成步骤更简单的α-葡萄糖苷酶抑制剂，国内外仍不断地致力于开发新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂。 图1阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇的结构式 二、实验材料与方法 1. 实验试剂 酵母(-葡萄糖苷酶、 对硝基苯酚葡萄糖苷(pNPG)、 金属离子和糖类、 槲皮素 (HPLC分析测试纯的大于98%)、 缓冲溶液0.01M的溶质(磷酸钠盐：pH=6.80) （1）槲皮素溶液的配制：称取3.02mg槲皮素溶解于10ml DMSO中，配成1μmol/ml。 （2）硫酸铜溶液的配制：称取2.50mg五水硫酸铜溶解于10ml蒸馏水中，配成1μmol/ml。 （3）(-葡萄糖苷酶溶液的配制：称取2mg酶，溶解在1ml缓冲液中。 （4）底物的配制：称取对硝基苯酚葡萄糖糖苷（pNPG）15mg，溶液((葡萄糖苷酶抑制活性的半抑制浓度IC50测定方法 在1.5mL的离心管中加入μl一定的样品溶液（DMSO溶解）μl (-葡萄糖苷酶溶液（.00mg/mL）μl，在室温下放置20min后，加入60μl 对硝基苯酚葡萄糖糖苷（pNPG）溶液（mg/mL），迅速混合均匀测定 nm处吸光度，由其随时间增长而上升的斜率反应速率。 μl）： 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0（空白） DMSO （μl）： 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 与缓冲液、酶液培育20分钟，加底物60μl，混合后400nm测光吸收随时间变化值。 不同浓度铜离子样品配制： 样品溶液（μl）： 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0（空白） 缓冲液 （μl）： 880 885 890 895 900 905 910 915 920 925 930 加入酶液10μl）后，培育20分钟，加底物60μl，混合后400nm测光吸收随时间变化值。 （2）((葡萄糖苷酶抑制作用类型动力学的测试方法 采用Lineweaver-Burk作图法判断。反应速率的测量方法。固定酶和样品浓度，改变底物浓度，得一系列反应速率值，以1/V对1/[S]作图，一条双倒数曲线。保持酶浓度不变，改变样品浓度，以同样方法得到另外几条双倒数曲线。根据双倒数作图确定可逆抑制类型，根据双倒数方程计算(的米氏常数Km和样品对(作用的常数Ki。 μl，25μl，30μl，35μl，40μl，45μl，50μl，55μl，60μl。 建议铜离子浓度：样品固定10μl，20μl。 建议槲皮素浓度：10μl，20μl 三、数据处理 （1）作图法求IC50值 根据实验结果，将没有加入样品时的酶活力定为100%，那么加入不同浓度样品后的酶活力为相对活力百分数(即残余活力百分数) 表1 槲皮素抑制活性结果 槲皮素体积/μL 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 槲皮素浓度/μmol/L 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 OD400 0.015 0.016 0.016 0.018 0.004 0.025 0.026 0.030 0.026 0.041 0.050 a/% 30 32 32 36 8 50 52 60 52 82 100 将相对活力与样品浓度（μmol/L）作图，从图上找出酶相对活力为50%时，样品的浓度，即为IC50值。 去除2个（3号、7号）误差大的数据后作图得： 图2 槲皮素抑制相对活力a-浓度c作图 从图中可以看出，相对活力为50%时槲皮素浓度大约为23μmol/L，即为IC50值。 （2