第十章免疫学检测技术详细分析.ppt

Ag* Ab Ag 标记抗原 特异性抗体 待测抗原 ( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合物 分离Ag*-Ab 和游离Ag* 从标准曲线上读知含量 测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性 放射免疫测定法(RIA)示意图 RIA法原理及标准曲线 75 50 30 10 0 1 10 100 1000 未标记抗原浓度（ng/ml) 结合/未结合的放射活性（%） 免疫印迹法(Immunoblotting) 将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒 如HIV 的抗体或抗原。 免 疫 印 迹 法 示 意 图 二 淋巴细胞 的测定 检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。 (1) 抗凝 静脉血 (2) 加等量NS (4) 密度梯度离心 血浆 分离液 RBC PBMC PMN (3) 混匀后，缓慢加于分离液上 一）淋巴细胞类型和数目的测定 1、花结试验：E花结试验可用于检测T细胞数目。EA花结试验可用于检测B细胞数目。 2、免疫荧光法：常采用间接免疫荧光法。 3、流式细胞术：借助流式细胞仪（FCM)。 花结试验示意图 T细胞功能测定 体外法 ：T细胞增殖试验 形态学检查 3H-TdR掺入法 MTT法 体内法 ： 用生物抗原或化学抗原作皮内试验。 OT-PPD(结核菌素试验)皮试 SD-SK (链球菌DNA酶-链激酶 )皮试 培养液 3H-TdR PHA 淋巴细胞 全血 分层液 离心 过滤 测量放射性 淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图 靶细胞 51Cr 洗涤 去除游离的51Cr 效应细胞 测量上清液中释放的51Cr 混合培养4-6小时 细胞毒试验（51Cr释放法）示意图 酶联免疫斑点法（Enzyme-Linked Immunospot, ELISPOT) 在ELISA的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。 CK抗体包被的反应板 CK 抗原包被的反应板 加入淋巴细胞 加入酶标记二抗 加入底物 检测抗原特异性B细胞 加入底物 T细胞产生CK的检测 加入淋巴细胞 加入酶标的CK抗体 MTT(四甲基偶氮唑盐）法 原理：在细胞培养终止前数小时加入MTT，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTT产生蓝色甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。 细胞毒试验 CTL介导的细胞毒试验：常采用51Cr释 放法 NK细胞的细胞毒试验：常用的靶细胞 为K562细胞 王晓杜 浙江农林大学 第十章 免疫学检测技术 利用免疫学原理建立的检测 技术，主要应用于对多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。 第一节 抗原或抗体的检测 抗原-抗体直接反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。 抗原-抗体反应可 用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。 免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。 抗原-抗体反应的特点 1.抗原-抗体的结合是特异性结合 2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合 3.抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段 可见的反应阶段 4.抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现 象，于两者的分子比例密切相关 抗原抗体比例对反应现象的影响 抗原-抗体反应受多种因素影响 1 电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为 稀 释液 ，以供给适应浓度的电解质。 2 温度：