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高级生物化学实验指导 四川农业大学生化研究室 二零一二年十月 目录 实验一 猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、 同工酶电泳……………………………………………..1 实验二 蛋白质分子量测定凝胶层析法…………………8 实验三 纳米磁珠法小规模提取质粒DNA及纯化鉴定………18 实验四 DNA的琼脂糖凝胶电泳………………………………21 实验一 猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、 同工酶电泳 一、原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶,他具有抗衰老.抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药化妆品、食品工业等方面具有了广泛地应用前景。 SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为CuZnSOD、MnSOD、FeSOD等三种。 CuZnSOD为二聚体，呈蓝绿色；MnSOD呈紫红色；FeSOD呈褐色。 SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。机构内0-的过量和不足均对集体不利，SOD对过量的02-的及时清理保证了集体内02-的含量相对平衡。集体内的O2-的形成可病理性和生理性两方面。在一些正常的生理过程中形成一些02-。例如：呼吸链中电子传递结果可以产生一些O2-。在某些疾病的过程产生大量02-如不及时清理，会对细胞损伤。SOD将02-，歧化为H202，而过氧化酶、股胖肝泰过氧化酶可以催化过氧化氢分解，在集体内形成一套解毒系统，对集体起防护作用。 本实验采用邮寄溶剂沉淀方法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并惊醒纯化。酶活力测定可用以下方法；邻苯三分自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺自氧化法、亚硝酸法等。 该实验sod酶活性采用邻苯三分自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应中，每分钟抑制邻苯三分氧化速率达50%的酶含量定义为一个酶的单位。样品中的蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯蓝G-250 Coomassic brilliant blue G-250）在在游离状态下呈紫色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000ug。 SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自①由基）能使氯化硝基四氮嗟蓝（NBT）由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布及活性大小）。 实验试剂与器材 [试剂] SOD的提取 ①ABC抗凝剂：柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml. ②0.9%NaCl0.9g，溶于100ml蒸馏水中。 ③丙酮 ④95%乙醇 ⑤氯仿 SOD活力测定 ①50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液 ②10mmol/L EDTA钠盐溶液 ③3mmol/L 领苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配制） 考马斯亮蓝G-250法测蛋白质 ①考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。 ②标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。 SOD同工酶鉴定 ①40%蔗糖[w/v]：称取40g蔗糖加重蒸水100ml。 ②10%过硫酸铵[Ap]：称过硫酸铵10g，溶于100ml重蒸水中。用时现配。 ③电极缓冲液：称取三时配羟甲基氨基甲烷6g，甘氨酸28.8g。用蒸馏水溶解并定容至1000ml，过滤后装入棕色瓶，4℃保存。 ④30%的Acr—Bis溶液：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸馏水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色瓶，4℃保存。 ⑤Tris-HCL，ph6.7缓冲溶液：Tris6.0g，加入1mol/L HCL 48ml，TEMED0.4ml,用浓盐酸调PH8.9后，再用蒸馏水定容至100ml。 ⑥Tris-HCI，PH6.7缓冲溶液：Tris6.0g,加1mol/L HCL 48ml,TEMED0.4ml,用浓盐酸调至PH6.7后，再用蒸馏水定容至100ml ⑦NBT溶液：核黄素吗（0.01%