LC—Q—TOF—MS结合PCC氧化反应快速鉴别熊胆粉中的2个新同分异构体.docVIP

LC—Q—TOF—MS结合PCC氧化反应快速鉴别熊胆粉中的2个新同分异构体 　　[摘要]建立了液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（LC-Q-TOF-MS）结合氯铬酸吡啶（PCC） 氧化反应对熊胆粉中2个新同分异构体进行结构确证。取熊去氧胆酸（UDCA）对照品和鹅去氧胆酸（CDCA）对照品，经PCC氧化后，用LC-Q-TOF-MS分析氧化物。再取熊胆粉样品，以甲醇提取后供LC-Q-TOF-MS测定。采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液（45∶55）。质谱采用正离子、负离子、MS及MS/MS模式分别测定。根据PCC可将仲醇氧化成酮的特性、UDCA与CDCA的立体异构性，可确证各氧化物的化学结构，并以确证结果对熊胆粉中2个新同分异构体进行鉴别，结果鉴别出熊胆粉中含3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸和7α-羟基-3-氧代-5β-胆烷酸2个新胆汁酸。 　　[关键词]熊胆粉；熊去氧胆酸；鹅去氧胆酸；氯铬酸吡啶；液相色谱-四极杆-飞行时间质谱；鉴别 　　熊胆粉为熊科动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品[1]，其化学成分复杂，含胆汁酸、胆色素、氨基酸和微量元素等[2-4]，其中胆汁酸被认为是熊胆粉的主要活性成分[2-3]。目前已知熊胆粉中的胆汁酸有牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸（UDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）、牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、去氢胆酸、tauroselocholic acid，tauroansocholic acid、牛磺熊去氧酮胆酸等[5-8]。 　　作者曾以液相色谱-离子阱质谱研究熊胆粉，结果发现在熊胆粉总离子流图中，在UDCA，CDCA的保留时间附近各具有1个未知色谱峰，其质荷比均比UDCA（或CDCA）的质荷比少2，推测为去氢UDCA或去氢CDCA。为控制产品质量，作者拟对其进行结构研究。由于无相应对照品供应，且自行分离制备对照品存在一定困难，故本研究拟采用液质联用法结合对照品半合成法进行结构确证。液质联用法采用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（LC-Q-TOF MS），因其具备提供精确分子量的功能，可增强确证结果的准确性。 　　对照品半合成法采用氯铬酸吡啶（PCC）试剂氧化UDCA和CDCA，使其羟基氧化成酮。该反应快速、温和，室温下可将伯醇、仲醇氧化成醛或酮[9-10]。UDCA与CDCA各含2个羟基（图1），均可被氧化成酮。UDCA化学结构中3-羟基与7-羟基的立体构象分别为3α，7β型[7]，但羟基氧化为酮后，3-酮或7-酮均无立体构象。因此，UDCA经PCC氧化后最多有3个产物，分别为图1中A，B，C。CDCA为UDCA的7-羟基立体异构体，其与UDCA应有2个相同的氧化物。经推测，CDCA氧化物的结构式分别为图1中B，C，D。由于各氧化物可通过HPLC进行色谱分离，且氧化物B，C的相对分子质量不同，因此可通过LC-Q-TOF MS进行鉴别。其他氧化物根据反应原理可随后得到鉴别。 　　在确证各PCC氧化产物结构后，采用LC-Q-TOF-MS测定熊胆粉样品，以氧化产物确证结果作为对照对熊胆粉图中的2个未知峰进行鉴别，结果确证为2个新同分异构胆汁酸。该方法快速、简便，鉴别出的2个新胆汁酸可为相关产品的质量控制提供参考。 　　1 材料 　　6550 iFunnel 液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪（美国Agilent公司）。UDCA，CDCA对照品，均由中国食品药品检定研究院提供，批号分别为0755-9003，110806-200303。熊胆粉由上海凯宝药业有限公司提供，批号090705。PCC试剂由上海晶纯试剂有限公司提供，批号20628。乙腈、甲醇、甲酸、冰醋酸均为色谱纯，水为Millipore 纯化水。 　　2 方法 　　2.1 色谱条件 Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色谱柱（3.0 mm × 100 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液（45∶55） ；进样后 0～1.5 min，流动相排至废液中，1.5 min后流动相切换至质谱中；流速 0.3 mL·min-1；柱温 30 ℃；进样量 1 μL。 　　2.2 质谱条件 ESI源；干燥气温度 220 ℃，干燥气流速 13 L·min-1；雾化气压力 242 kPa；鞘气温度 350 ℃，鞘气流速 11 L·min-1；分别测定正、负离子；毛细管电压 3 500 V；毛细管出口电压 200 V；采集模式MS和MS/MS；在MS/MS模式下，碰撞能量 50 V；参比离子m/z 121.050 873， 9