利用EXCEL对竞争ELISA数据进行自动处理.doc

利用EXCEL自动处理竞争ELISA数据 作者：栀子花开 在前文《【第九届原创】基于VBA的酶免数据处理程序设计》（/topic/6232935）曾提到，下一步拟对禁用物质及兽药残留等检测项目设置模板，加入标准曲线拟合及绘图功能，使原始记录更加丰富。经过摸索，成功实现了该功能，现简介如下： 1竞争ELISA原理 以克伦特罗残留ELISA试剂盒为例：试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的克伦特罗和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物克伦特罗的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中克伦特罗的残留量。 2竞争ELISA结果的计算 目前常用德国*发公司RIDA***软件计算。该软件的通用性较强，可适应多种酶标仪，数据处理报告的内容也比较丰富，包含原始OD值、标准曲线图、IC50（50%抑制浓度）、各样品残留量等信息。但该软件存在着一个非常严重的缺陷：当软件读取酶标仪数据后，可以对数据（OD值）进行修改后再进行结果的计算。这与《检验检测机构资质认定评审准则》4.5.16条款严重不符，存在着数据被软件操作者或其它人员篡改的可能。 当然，也可以在坐标纸上采用半对数曲线形式绘出标准曲线，然后根据标准曲线计算样品含量。采用这种方法有较明显的缺点，一是采用人工方法无法精确描绘标准曲线；二是计算样品含量时也只能粗略估算。 3 EXCEL数据处理模型的建立 在RIDA***软件中对数据采用半对数处理，X轴取浓度的对数，Y轴取B/B0值（样品OD值/空白OD值），绘出的是一条反S曲线。如果在EXCEL中也采用半对数坐标拟合标准曲线，因为并非一条直线，因此较难拟合。 半对数处理的标准曲线图 针对此，在参考文献的基础上，对数据采用双对数处理，即logit-log直线回归模型。X轴取浓度的对数，Y轴取经Logit模型处理后的B/B0值，然后进行曲线回归后即可计算出y=ax+b中的各个常量。 双对数处理的标准曲线图 从上述两图可以明显看出，采用双对数处理的标准曲线图更接近一条直线，在EXCEL也更便于进行曲线回归处理。 4 EXCEL回归方程常量的计算 在EXCEL中分两列输入浓度及OD值，利用插入图表功能绘图，在绘制出的曲线上右击并添加趋势线，并在选项中选中“显示公式”和“显示R2值”，即可在图表区显示公式及R2值。但一般情况下我们只知道该公式y=ax+b中的常量a和b是多少，却并不知道如何从原始数据中计算出来，结果就是在一般情况下，要计算样品的结果，需要手工将a和b复制到某一单元格，或将其手工输入到计算样品结果的公式中，不能实现样品结果的自动计算。这样一方面容易在数据输入过程中出错，另一方面也在很大程度上影响了数据处理的效率。 要解决这个问题其实不难，采用最小二乘法对标准曲线的原始数据进行最佳拟合，并返回描述此直线的数组，然后从数组中提取相应的数据即可（具体可参照网络上的相应教程）。在获取常量a和b后，根据x=(y-b)/a即可计算出样品含量。采用这种方式后，只需知道标样的浓度、OD值，以及样品的OD值，就可以计算出各样品的含量，实现了数据的自动计算。 5与RIDA***软件计算结果的一致性 对一次实验结果数据进行了实际比较，两者计算结果如下：  ID RIDA***软件结果/ppt 自编方法结果/ppt 偏离程度/% 1 93.4 93.3 -0.06 2 1142.9 1173.5 2.68 3 out of range out of range / 4 939.7 959.5 2.11 5 138 138.7 0.48 6 213.2 209.4 -1.76 7 179.5 178.0 -0.85 8 out of range out of range / 9 187.8 185.7 -1.12 10 230.6 225.8 -2.09 11 208.9 205.4 -1.67 12 55.5 45.2 -18.56 13 54.1 43.0 -20.53 14 out of range out of range / 15 62.6 55.7 -11.10 16 79.8 77.8 -2.56 17 945.9 966.0 2.13 18 2675.1 2770.5 3.57 从上述数据可以看出，在标准曲线（100ppt~8100ppt）范围内，本方法计算结果与RIDA***软件计算结果的一致性还是非常好的。当含量低于标准曲线最低浓度时，由于拟合方式不同，计算结果出现较大偏差，但此时的数据在报告中均作为“未检出”报告，偏差稍大仍在可接受范围之内。 6与酶免数据