分子生物学基本技术资料.ppt

聚合酶链反应 (polymerase chain reaction; PCR) PCR：在体外由引物(primers)介导,利用酶促反应获得特异基因组DNA或cDNA的专门技术，又称基因扩增技术。 反应体系的基本成分：模板DNA、 引物、四种dNTP、耐热性DNA 聚合酶、以及含有Mg2+的缓冲液 酶切位点的引入 限制性酶切位点在引物的5‘端的顶端 最好利用引物本身的碱基，减少引物的长度 Tm控制在55-58以上，避免发卡、二聚体及非特异性等问题 酶切位点的加入保护性碱基3-6个（可以查阅） 上下游引物的酶缓冲体系尽量一致 相邻的两种酶切位点不能同时选用 RT-PCR 以总RNA、mRNA为模版，经反转录生成cDNA 以cDNA为模板，经PCR合成大量目的基因片段 ? 　 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。 ? Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 反应原理 引物序列 Upstream: 5-GAGAGTCCATGGCCTCAG-3 Downstream: 5-GCAAGTCAAGCTTTATTCACTCTG-3 突变体引物设计：