经单孔腹腔镜法原位移植骨髓间充值干细胞治疗糖尿病的实验研究.docVIP

经单孔腹腔镜法原位移植骨髓间充值干细胞治疗糖尿病的实验研究 　　摘要：目的：通过猪的动物实验，对比经脐单孔腹腔镜法与开腹法行原位移植骨髓间充值干细胞治疗糖尿病的疗效。方法：分离、纯化、培养雄猪的骨髓间充质干细胞，原位移植雌猪的糖尿病模型，（分为单孔腹腔镜组、开腹组、对照组和空白组） ，对比4组的术后血糖、胰岛素水平以及单孔腹腔镜组和开腹组的首次进食时间。结果：空白组和糖尿病组间、糖尿病组和移植二组间平均血糖和平均胰岛素的结果P0.001，差别有统计学意义，而移植二组的开腹组和单孔腹腔镜组间平均血糖和平均胰岛素的结果差别无统计学意义。单孔腹腔镜组和开腹组首次进食时间的比较结果P0.001，差别有统计学意义。结论：在糖尿病或胰腺损伤状态下，原位移植骨髓间充值干细胞能够有效治疗糖尿病。完全经脐单孔腹腔镜治疗可达到和开腹相近的疗效，并且术后切口疼痛明显减轻，有助于血糖恢复。 　　关键词：单孔腹腔镜；猪；骨髓间充质肝细胞；原位移植；糖尿病 　　数十年间，临床治疗糖尿病的策略主要是口服降糖药物和胰岛素替代。但是，口服药物仅能在一定程度上缓解症状；胰岛素替代疗法可明显减少1型糖尿病并发症，而并不能防止其发生，HbA1c水平仍不正常，且低血糖发生率较高。近期研究进展为：已从胚胎干细胞和多种成体干细胞体外分化获得胰岛样细胞团，并进行动物体内移植，证明可有效降低血糖[1]。建立糖尿病和胰腺损伤动物模型，在体内形成胰腺微环境，可诱导骨髓间干细胞向胰岛细胞分化，并逆转糖尿病。 　　近年来，随着生活水平和审美需求的进步，人们对更小手术创口、更快术后恢复的追求使腔镜手术不断发展，单孔腹腔镜手术（laparoendoscopic single-site surgery，LESS）应运而生[2]。LESS手术具有单一切口，术后切口并发症少、体表疤痕少等优点，正得到逐步应用。 　　本文通过经单孔腹腔镜法原位移植骨髓间充值干细胞（MSCs）治疗糖尿病这种更加微创的实验研究，从一定程度上为微创的胰腺原位骨髓间充质干细胞移植对有效利用干细胞资源的新策略，以解决临床糖尿病治疗中干细胞移植物来源严重短缺的问题提供理论和现实依据。 　　1.实验动物： 　　4周龄雄性贵州小香猪2只，10周龄10kg体重贵州小香猪17只，购自四川大学实验动物中心。 　　2.方法 　　2.1.雄性猪的骨髓间充质干细胞分离和纯化 　　2.1.1.骨髓间充质干细胞的采集：雄性猪禁食水6小时以上（以免操作时试验动物呕吐和误吸），用氯胺酮（10个毫克/公斤）进行麻醉，无菌条件下以小号骨髓穿刺针穿刺雄猪髂后上棘，并提取骨髓（通常穿刺的骨髓量在5ml以上），每次手术不超过三次穿刺，正常骨髓性状为粘稠深红色。 　　2.1.2.骨髓间充质干细胞的培养和纯化： 　　1）原代培养：获得的雄猪骨髓再注入Hank’s液中，冲洗骨髓腔中的细胞，收集后1200rpm离心7～8分钟；离心后弃上清，用混和培养液吹打细胞沉淀，使之形成细胞悬液并进行细胞计数；取含有细胞的混合培养液按细胞培养密度1～1.5×106个细胞/瓶接种于细胞培养瓶中，并用混合培养液I补足至培养液总量为8～10ml，培养两天； 两天后弃去培养液的一半，再加入4～5ml新鲜的混和培养液，置于二氧化碳孵箱继续培养使细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养； 　　2）纯化：待细胞生长至对数生长期后，取培养瓶镜下观察，见干细胞已铺满瓶底95%，则予以传代。移去原代培养瓶内的细胞培养液，用PBS溶液清洗细胞2～3次，然后向培养瓶中加入1～2ml0.125%（质量体积百分比）的胰蛋白酶酶溶液（含0.1%EDTA），在二氧化碳孵箱中放置2～3分钟，观察，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液；加入5～7ml混和培养液，吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬液，经1200rpm离心7～8分钟，弃上清，加入8～10ml混和培养液，计数；将含有细胞的混和培养液按接种密度1～1.5×106个细胞/瓶接种于新培养瓶中，并用混合培养液补足至培养液总量为8～10ml，培养至细胞生长良好，形态均一，即完成传代培养并纯化。 　　2.2.MSCs细胞的鉴定 　　流式细胞仪鉴定：收集培养的第3 代MSCs ，PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤3次，分别加入CD29、CD90、CD44、CD45、CD166 单克隆抗体，工作浓度1：100，4 ℃孵育30 min 后，再用PBS洗涤3 次，加异硫氰酸荧光素（ FITC） 标记的二抗，工作浓度1：100 ，4 ℃孵育30 min PBS 洗涤3次，流式细胞仪检测。同时用PBS 代替一抗作空白对照。 　　2.3.猪糖尿病模型制备 　　将15只雌性贵州小香猪，75%医用23酒精消毒雌性小香猪耳缘，以70%四氧嘧啶和30%S