二苯胺分光光度法测定发酵液中的二羟基丙酮.docVIP

二苯胺分光光度法测定发酵液中的二羟基丙酮 李 华，刘宇鹏(，孙 杨，周中赛 （河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封 475004） 摘要：本研究建立了甘油为底物发酵液中二羟基丙酮的分光光度检测方法。考察显色剂的用量、反应温度、反应时间、显色稳定时间、发酵液成分发酵液中菌体自溶物等对测定的影响。该方法的相关系数R2=0.999，检测范围0.1～0.4 g/l，样品回收率达102.4%，测定结果不受发酵液中甘油及其杂质影响，具有快速准确的优点。 关键词：分光光度法；二苯胺；1,3-二羟基丙酮 Determination of 1,3-Dihydroxyacetone in Fermentation Broth by Diphenylamine spectrophotometry LI Hua, LIU Yu-peng(, SUN Yang, ZHOU Zhong-sai (Institute of Biotechnology, College of Life Science, Henan University, Kaifeng 475004) Abstract: A spectrophotometry method was established for the determination of 1,3-dihydroxyacetone of the fermentation broth using glycerol. Several factors influencing the determination were studied, such as the amount of color reagent, reaction temperature, reaction time, color stability time, broth composition and cell autolysis in the broth. The detection limits and recovery rate were 0.1～0.4 g/l (r2=0.999) and the average recover was 102.4%, respectively. The results showed that glycerol and other impurities in the fermentation broth have no significant interferences to the determination of 1,3-dihydroxyacetone, and this method proved to be fast and accurate . Key Words: spectrophotometry; diphenylamine; 1,3-dihydroxyacetone  二羟基丙酮(1,3-dihydroxyaceton，简称DHA，1)是一种天然存在的酮糖，具有生物可降解性，对人体和环境无毒害可食用。是一种重要的医药中间体，也可作为一种抗病毒试剂 [1]。1能与皮肤最上层物质（如角质层内的氨基酸）发生Maillard反应使皮肤达到棕色到深色的染色效果。根据这一原理1在临床上被广泛应用于治疗白癫风[2]，它也被用来做为混合型卟啉病的保护剂[3]。还有研究表明在紫外照射下1能延缓皮肤癌变[4]。 1的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成，国外比较成熟的工业生产主要是用含有甘油脱氢酶的微生物甘油发酵生产。目前，发酵液中1检测方法有气相色谱法[5]、高效液相色谱法[6]、薄层[7]。气相色谱法测定时1不能直接汽化，需要进行衍生化，操作繁琐；液相也比较耗时。薄层层析法只能定性分析，无法精确定量。在酸性溶液中1的酮基与二苯胺（diphenylamine，2）的氨基发生反应生成蓝色复合物，在608 nm处吸光度与1的浓度呈线性关系在酸性下，2不与甘油发生反应。根据这一原理建立了一种准确、简便、灵敏的以甘油为底物发酵液中1的比色检测方法。目前国内尚未有专门文献对2分光光度法系统研究报道。  图1 2法反应原理 1 仪器与试剂 TU-1201型紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器设备有限公司）； 1512型高效液相色谱仪（美国Waters公司）。 1（Bio Basic公司）；2（上海试剂三厂）；无水乙酸；浓硫酸甘油酵母粉；磷酸二氢钾。 菌种：葡糖杆菌Gluconobacter sp. HD 410，由河南大学生物工程研究所筛选并保藏。发酵培养基成分：甘油10%，酵母粉1.5%，无水KH2PO4 0.5%，pH自然。 2方法与结果 2.1 溶液配制 1溶液：称取1 1 g，于1000 ml容量瓶中