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蛋白质活性测定方法

核糖核酸酶(RNase)的活性测定 (1)溶液的配制: ① 0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液:称取5.78 g CH3COONa, 加入1.7 mL CH3COOH, 用蒸馏水稀释至500 mL。 ② 0.05 % RNase酵母溶液:称0.05 g RNase酵母,用0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液溶解并稀释至100 mL。 测活方法: (2)用移液管移取已配制好的0.05 %的核糖核酸酵母溶液2.5 ml于比色皿中,加入一定量的样品RNase A溶液,迅速摇匀,以蒸馏水为参比,在300 nm波长下每隔30秒测一次吸光值,共读3分钟, 得到一组对应于时间t(min)的At值。当样品管反应3小时后再测定300 nm处的吸光值Af, Af为最终的光吸收,分别求得一组对应于t的log(At-Af), 以log(At-Af)对时间t作图应得到线性关系,画出直线。求出直线斜率的数值S,将S带入标准曲线,求得活性回收率。将S带入下列公式中,可求出酶的活力。 单位 / mg = S × (-2.3) ×4 / (样品管中含酶的数量) 胰凝乳蛋白酶(α-Chy)活性测定 用胡梅尔(Hummel)法测定α-胰凝乳蛋白酶[2]: (1) 原理:α-胰凝乳蛋白酶优先催化水解结合有氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的L-异构体)的肽键。我们可以通过在256 nm处测定吸光度增大值的办法来测定反应的速度。苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的水解反应引起吸光度的增大。 (2) 定义:一个凝乳蛋白酶单位相当于在pH值为7.8,温度为25 ℃时,每分钟水解1 μmol苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)所需的酶量。 (3) 试剂配置方法: Tris缓冲液(pH: 7.8)取0.969 g三(羟甲基)氨基甲烷和1.47 mg二水氯化钙溶于80 mL蒸馏水中,用1 N的盐酸将pH值调至7.8,并定容至100 mL。 ①盐酸(HCl): 0.001 moL/L ②酶溶液:先用盐酸溶解酶,使溶液浓度达到1 mg/mL,然后再用盐酸稀释,使最终浓度达到0.5~1.0 U/mL。 ③底物溶液:取33.5 mg苯甲酰-L-酪氨酸乙酯溶于50 %的甲醇(63 mL甲醇与50 mL蒸馏水混合),定容至100 mL。 (4)操作步骤:用移液管将1.5 mL Tris缓冲液和1.4 mL底物溶液滴入一只1 cm比色皿,并加热至25℃,加0.10 mL酶溶液,摇匀。用分光光度计(256 nm)测定反应混合物的吸光度,在约5.0 min内每隔1.0 min读取吸光度一次,直到每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。 (5)计算  用以下公式计算酶的活性: 式中:E256—在256 nm处测得的每分钟内吸光度的增大值 Ew—每0.10 mL所用酶液中含酶的重量(mg) 0.964—1 μmol BTEE的吸光度(256 nm处) 3—反应液的总体积 胰蛋白酶(Trypsin)的活性测定 用施韦尔特-竹中(Schwert Takenaka)法测定胰蛋白酶[3]: (1)原理:胰蛋白酶将N-苯酰基-L-精氨酸从BAEE中释放出来,用分光光度计于253 nm处跟踪测定由该反应引起的吸光度增大情况。 (2)定义:一个胰蛋白酶单位相当于在规定条件下每分钟使吸光度增大0.001时所需的酶量。 (3)试剂配置方法: ①底物溶液:取30.9 mg BAEE,280 mg二水氯化钙和566 mg三羟甲基甲烷溶于70 mL蒸馏水中,将pH值调至7.6。定容至100 mL。 ②盐酸(HCl):0.001 mol/L ③酶溶液:酶用0.001 N盐酸溶解。1.0 mL配制酶溶液中应含有150 U左右。 (4) 操作步骤:用移液管将2.8 mL底物溶液滴入1 cm比色皿,调温至25 ℃。添加0.20 mL酶溶液,混合。用分光光度计于253 nm处以蒸馏水为参比测定吸光度,直至每分钟吸光度增大值达到恒定为止。 (5) 计算: 用以下公式计算活性: 式中 E253—每分钟内253 nm处吸光度的增大值 0.001—一个酶单位每分钟使吸光度增大0.001 Ew—0.2 mL所用的酶溶液中含酶的重量(mg) Lys活性的测定 取溶壁球菌干菌粉少许,加入少量0.067 mol/L的磷酸缓冲液(pH=6.2),用玻璃棒研磨匀浆,再加入磷酸缓冲液至OD值为0.6-0.8即可。用移液管移取3.0 mL配置好的溶壁球菌菌液于比色皿中,加入一定量的Lys溶液(酶量在100 ug左右),迅速摇匀,以蒸馏水为参比,在450 nm的波长下每隔30秒测一次吸光值,共读3分钟,以吸光度对时间作图,取最初线性部分,其斜率即为吸光度值的变化率。在以吸光度值的变化率对加入标准蛋白的质量作图,用同样的方法测定样品的吸光

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