TGF―β1对肾小管上皮细胞转分化作用的相关性研究.docVIP

TGF―β1对肾小管上皮细胞转分化作用的相关性研究 摘要：目的：观察TGF-β1在诱导大鼠肾小管上皮细胞系（NRK-52E）的上皮-间充质转分化作用。 方法：选择E钙粘附蛋白为上皮细胞标志物，α平滑肌动蛋白（α-SMA）为间叶组织标志物，以低血清培养的NRK-52E做为对照组，低血清培养的NRK-52E细胞经TGF-β1（10ng/ml）诱导72小时，分别以免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测NRK-52E的转分化状态。 结果：RT-PCR和免疫细胞化学染色结果均显示，NRK-52E细胞经TGF-β1体外诱导72小时后，其上皮细胞标志物E钙粘附蛋白的mRNA和蛋白的表达与相应的对照组相比明显减弱，同时其间叶组织标志物α-SMA mRNA和蛋白表达与相应的对照组相比均增强，表明培养的NRK-52E经TGF-β1体外诱导72小时发生了上皮-间充质细胞的转分化。 结论：TGF-β1成功的诱导大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）发生转分化。 关键词：TGF-β1 肾小管上皮-间充质细胞转分化 肾脏纤维化 【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）04-0020-01 众多的实验显示，在肾小管上皮细胞转分化的复杂过程中可能受很多因素的影响[1]。而TGF-β1是目前为止被证实和公认的较明确可独立引起肾小管上皮细胞转分化的诱导因子并可调节整个EMT过程，进而可促进肾脏纤维化的发生[2]。基于此，本实验以体外培养大鼠的肾小管上皮细胞系（NRK52E）为研究对象，观察TGF-β1诱导体外培养的NRK-52E细胞对NRK-52E细胞的转分化表型的改变，期望能为肾间质纤维化的预防和治疗学提供更确凿的理论基础。 1 材料和方法 1.1 材料。 （1）细胞株 大鼠肾小管上皮细胞株，NRK-52E细胞株购于中国科学院上海细胞生物研究所。 （2）主要试剂：①抗体：E-钙粘附蛋白（E-cadherin，上皮细胞标记物）和α-平滑肌动蛋白（α-SMA，间叶组织标记物）的单克隆抗体均购于博奥森生物有限公司；②免疫组织化学UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒和DAB显色液均购自福州迈新生物技术公司；③引物：参照Medline 网上的基因序列，设计E-钙粘附蛋白（E-cadherin）、α-SMA的PCR引物序列，由上海生物工程有限公司合成。 1.2 方法。 1.2.1 NRK-52E细胞培养、传代、冻存和复苏。 1.2.2 TGF-β1诱导体外培养NRK-52E细胞的形态学观察。 1.2.3 免疫细胞化学染色检测TGF-β1诱导体外培养NRK-52E细胞的转分化。 1.2.4 RT-PCR检测TGF-β1诱导体外培养NRK-52E细胞的转分化。 1.3 统计学方法。计量资料以均数±标准差（X±S）表示，进行两样本均数比较的t检验分析，由SPSS12.0软件统计包完成。检验水准：α 0.05。实验重复三次观察。 2 结果 2.1 TGF-β1诱导培养的NRK-52E细胞形态、细胞免疫细胞化学染色结果和间充质细胞标记物α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）的染色结果。相对于对照组，TGF-β1诱导培养，使NRK-52E细胞的上皮细胞标记物E-钙粘附蛋白的表达明显减少和消失，间充质细胞的标记物α-SMA表达明显增高，说明TGF-β1诱导NRK-52E细胞发生了上皮-间充质细胞的转分化。 2.2 RT-PCR检测TGF-β1诱导的NRK-52E细胞E-cadherin、α-SMA的mRNA表达结果。从表1中我们统计分析了在对照组与实验组中E-钙粘附蛋白、α-SMA、的表达，可见上皮组织标记物E-钙粘附蛋白在对照组与实验组中表达有下降趋势，且在对照组与实验组中表达有显著性差异（P 0.01）。而间叶组织标记物α-SMA在对照组与实验组中表达有上升趋势，且在对照组与实验组表达有显著性差异（P 0.01）。 3 讨论 从本实验的结果观察得出TGF-β1培养的NRK-52E72小时后上皮细胞标志物E-钙粘蛋白的丢失；胞浆内出现α-SMA微丝，支持了大量研究证实的肾小管上皮细胞转分化的现象，即失去上皮的细胞表型E-钙粘附蛋白表达，细胞内的微丝发生改变，产生了纤维母细胞的细胞表型，如a-SMA蛋白。 同时，为了进一步完善实验，本实验又通过RT-PCR来检测上皮细胞的标志物E钙粘附蛋白及间叶组织的标志物a-SMA蛋白mRNA水平的表达。从实验结果中得出上皮细胞标志物E-钙粘蛋白的丢失；胞浆内出现α-SMA微丝，与免疫细胞化学结果一致。支持了Yang[3]及其同事用TGF-β1诱导人类近端小管上皮细胞中观察到上皮细胞转分化的现象，从而证实了TGF-β1能成功的诱导了肾小管上皮细胞向间充质细胞的转分化。为肾脏纤维化的预防与治疗提供了理论基础