氨基酸测定.docVIP

茚三酮显色法测定氨基酸的含量 一．原理： 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共 热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。 二．仪器： 721型分光光度计 台天平 减压蒸馏器 干燥 容量瓶 移液枪 烧杯 试管 架 试管 水浴锅。 三．药品： （1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液 （2） pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。用pH 检查校正。 （3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解 （4）60％ 乙醇。 （5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。 茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。 还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。 乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。 四、操作步骤 1．标准曲线的制作 分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。 以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 1 2 3 4 5 6 0.3 mmol 标准氨基酸溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 2mol/L醋酸缓冲液 1 1 1 1 1 1 茚三酮显色液 1 1 1 1 1 1 OD570 混匀，盖住试管口后在100°水浴加热15min，然后用自来水冷却。 放置5min 后，加入3ml 60%的乙醇稀释，充分摇匀。 2．氨基酸样品的测定 取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。 将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。 4.1光度分析法 β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 4.1.1试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc－HAc缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取1.020 gβ-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取0.5g茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。 4.1.2标准曲线的确定 分别准确移取0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml再加入1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 4.1.3样品的测定