血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定-lhy技术总结.ppt

* * 血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定 （见P157） 背景： 关键问题： 血清蛋白根据电泳法可分为5类：清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。 1.采用何种方法分离？ 2.此种方法分离会引入何种杂质？ 如何纯化？ ——盐析 ——凝胶层析 3.如何鉴定纯度和含量？ ——电泳和双缩脲法定量 一、原理及操作 利用高浓度的中性盐，如(NH4)2SO4、 Na2SO4、 Na2SO3和NaCl等破坏水化膜，中和表面电荷。 　　盐析法一般蛋白质不变性，常用于蛋白质的分离纯化。 1. 盐析 50%饱和(NH4)2SO4 清蛋白溶解 球蛋白沉淀 33%饱和(NH4)2SO4 其余球蛋白溶解 γ-球蛋白沉淀 饱和(NH4)2SO4 1ml 边加边摇！ 弃上清 加PBS溶解沉淀至1ml 静置5min 3500r/min 5min 1） 饱和(NH4)2SO4 0.5ml 边加边摇！ 弃上清 加PBS 0.5ml溶解沉淀 静置5min 3500r/min 5min 2） 取1ml血清 作1ml标记线 2. 脱盐 1） 装柱 排气、调整凝胶浓度、装柱 2）加样 上步样品加样、进样、洗样 3）洗脱收集 PBS洗脱；收集（1ml/管)； 4）检测 收集约10管 4）检测 NH4+检测（纳氏试剂） 蛋白质检测（双缩脲试剂） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1滴洗脱液+1滴检测试剂 1滴洗脱液+1滴检测试剂 5）收集脱盐的蛋白质液进行鉴定 3. 鉴定 1）纯度鉴定 2）含量鉴定 醋酸纤维薄膜电泳 双缩脲法定量 电泳技术是利用带电粒子在电场中向与其所带电荷相反的电极移动的现象，对混合物组分进行分离、纯化、鉴定和定量的技术。 电泳技术 （见P34） V = EQ 6πrη 电泳缓冲液：pH=8.6 12~18 9~11 4~7 2~3.5 60~70 含量（%） 30 9~15 30 5~20 6~9 分子量（×104） 6.85~7.5 5.12 5.06 5.06 4.64 pI γ球蛋白 β球蛋白 α2球蛋白 α1球蛋白 清蛋白 血清蛋白 表10-1 血清蛋白含量参考（ P89 ) 血清蛋白泳动方向？ 各种血清蛋白泳动顺序？ 1）电泳前准备 2）点样（ 各组点γ-球蛋白液、每个电泳槽点2份血清） 无光泽面点样、量少、一次、迅速 电泳操作 3）上槽 点样面朝下、点样线勿接触滤纸桥,置负极 4）电泳 120V；40min 5）染色 丽春红染色液中浸泡 2min 6）漂洗 依次进行三次漂洗，至背景无色 蛋白双缩脲法定量 （见P159） 肽键 ＋Cu2+ OH- 紫红色复合物 蛋白质浓度与A540呈正比 混匀后置37℃ 20min 1.5 1.5 1.5 2.0 0.9%NaCl 4.0 4.0 4.0 4.0 双缩脲试剂 — — 0.5 — 蛋白质标准液 As A540 0.5 — — — γ-球蛋白液 — 0.5 — — 1:10稀释血清 测定管2 测定管1 标准管 空白管 试剂 A1 A2 血清蛋白浓度(mg/ml)=A1/As ?6.0 ? 10 γ球蛋白浓度(mg/ml)=A2/As ? 6.0