实验三酶促转氨反应汇总.pptVIP

实验三 酶促转氨反应 一 实验原理 在动物机体中活力最强、分布最广的转氨酶有两种：一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶（简称GPT），另一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶（简称GOT）。它们的催化反应如下： GPT 丙氨酸+α-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 此反应最终产物都是丙酮酸。测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性。 丙酮酸可与2,4?–?二硝基苯肼反应，形成丙酮酸二 硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色。再与同样处理 的丙酮酸标准液进行比色，计算出其含量，以此测 定转氨酶的活性。 ? 丙酮酸?+?2,4?–?二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙（棕红色）  二 实验步骤 1. 称取0.3g叶片——用剪刀将叶片剪碎——放于研钵中。 2. 量取4ml磷酸缓冲液，分三次加入研钵中（2，1，1），研磨成浆状，到入离心管中，5000rpm 离心10min, 上清液即为酶粗提液。 3. 取4支试管——编号——按下表要求加样: 三、计算： * * * 氨基酸分子上的氨基转移到α-酮酸分子上的反应称转氨反应。由转氨酶催化的转氨反应是氨基酸代谢的重要反应之一。经转氨后，原来的氨基酸变成了酮酸，而原来的酮酸则变成新的氨基酸。 0.1 0.5 0.6 磷酸缓冲液(ml) 0.5 标准丙酮酸液(ml) 0.5 Ala和α-酮戊二酸(ml) 0.1 0.1 酶粗提液（ml） 4 (样品管) 3 (标准管) 2 (对照管) 1 (空白管) 试管号 4.加样完毕 摇匀 用橡皮筋将4支 试管扎牢 置于40℃水浴中加热30min。 5.取出冷却 每支试管各加0.5ml 2，4-二硝基苯肼 反应5min 再每支试管各加5ml 0.4N的 NaOH溶液 摇匀 静止10min 在λ=530nm下，测量吸光度OD值。 按下式计算丙酮酸生成量： Cx=样品中丙酮酸含量 Cs=标准丙酮酸溶液含量(0.002mM/ml) V=标准丙酮酸溶液毫升数 Dl=样液OD530 D2=标准液OD530 D3=对照管OD530 * *