3感受态细胞的制备与重组子的筛选-王案例.ppt

感受态细胞的制备和转化及重组质粒的筛选 1、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 2、熟悉实验的操作具体步骤 3、掌握蓝白斑筛选重组质粒转化的原理 实验目的 实验原理与方法 冷CaCl2转化原理： 感受态：细胞处于能够摄取外源DNA的状态称感受态，处于感受态的细胞称作感受态细胞。 受体细胞处于0℃、CaCl2低渗溶液处理后，细胞膨胀呈球形，细胞膜的通透性发生改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞( Competent cells )，外源DNA吸附于细胞表面，经42 ℃短时间热击处理，促使细胞吸附DNA复合物。 冷CaCl2转化过程： 转化（transformation）是质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 （1）吸附 双链DNA吸附于受体菌表面。 （2）转入 双链DNA分子进入菌内。 （3）自稳 外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链。 （4）表达 体外基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增值和表达。 操作步骤 1）感受态细胞的制备(CaCl2法) 从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于3-5ml LB液体培养集中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期； 再将该菌悬液以1：100的比例接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600 达0.5左右； 取培养好的菌液1.5ml于Ep管中，冰上放置5min；4℃，4000rpm离心10min，去上清，收集菌体。从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳 用500ul预冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10min。 4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，加入50ul预冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞后置于冰上，即制成了感受态细胞悬液。 全程保持低温 向感受态细胞中加入10ul重组质粒DNA溶液，轻轻混匀，冰浴30min。Ep管4 ℃预冷 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90s（不要摇动Ep管！），然后将Ep管迅速转移到冰上，冷却5min。 向上述管中加入400ul 的LB液体培养液，然后37℃，100rpm，振荡培养约45-60min 。（此时间段可以去吃饭） 2）转化 取100ul转化细胞至含有抗生素（氨苄青霉素）的LB平板上，用灭菌的玻璃棒（一定要冷却后再涂菌！）涂布均匀，室温放置待菌液完全被吸收后，倒置培养皿，37℃培养过夜。 重组子的筛选： （1）抗生素筛选法 质粒携带有选择性抗生素基因（如氨苄青霉素等），可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素而无法存活。 （2）互补法 蓝白斑筛选（IPTG-Xgal）试验： 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 pUC18载体上带有氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene）和lacZ’基因。 氨苄青霉素抗性基因能够区分出转化子（携带有pUC18载体的受体菌）和非转化子。 蓝白斑筛选则能在转化子的基础上区分空载体和连接成功的载体（连接上SOD基因的pUC18载体）。 细菌染色体 含有lacZ基因C端序列 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株 LacZ’基因 多克隆位点 β-半乳糖苷酶启动子 IPTG 非代谢性的乳糖启动子诱导剂 激活 载体 生成 含有X-gal和IPTG的培养基 有活性的 β-半乳糖苷酶 细菌染色体 含有lacZ基因C端序列 活性的 β-半乳糖苷酶 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株 插入片段到多克隆位点 lacZ‘基因被破坏 载体 无法生成 含有X-gal和IPTG的培养基