蛋白质组学结构测定解析.ppt

* 针对不同的样品，电镜又可以细分为3种方法。其中比较重要的是单颗粒技术。 * * 这篇是5月7日发表在science上的最新成果。电镜的分辨率已经达到了2.2 A。 * 目前已知的蛋白质结构有90%是用x射线晶体学获得的，但是x射线晶体学也面临一些问题。 * 通常对光源的宽度要求是不大于晶体宽度。正是由于这几个优点，使得可以使用很小的晶体，同时避免了辐射损伤。 * X射线自由电子激光和x射线晶体学原理一样，实验中首先获得纳米尺度大小的蛋白晶体配制成一定浓度的悬浮液，样品流从进样针中流出，在真空反应腔中飞行，然后与X射线脉冲相互作用产生衍射，最后由两组CCD检测器收集衍射点。 * * 回顾一下前面提到的问题，有：辐射损伤，获得好的晶体，进行检测样品的准备。 通过前面的实验，我们已经大体上能够解决这些困难了。利用X射线自由电子激光的飞秒脉冲代替同步辐射源解决辐射损伤，由于自由电子激光的超高光强因此只需要纳米尺度的蛋白晶体即可，同时晶体结构的测量可以在完全的水环境下进行，而不需要冷冻干燥。 * 上一篇文章发布的时间是在2011年2月，获得的分辨率为8.7 ?。在之后的几年内，X射线自由电子激光又有了很大的发展：（Table 1） 在2012年1月，通过在Sf9昆虫细胞内异源表达布氏罗德西亚锥形虫的组织蛋白酶B同时形成晶体，然后再裂解细胞分离得到晶体，然后将样品流通过X射线自由电子激光进行衍射实验，最终获得的晶体结构的分辨率为7.5 ?。（文献3） 在2012年7月，通过将X射线自由电子激光聚焦到直径3微米内，对每个晶体的体积小于3立方微米的溶菌酶晶体样品流进行衍射实验，成功获得了分辨率达到1.9 ?的衍射数据。在实验中，由于激光的强度太大且晶体太小，晶体在被单个脉冲照射产生衍射图后便气化了。（文献1） * 随后的研究获得的分辨率也不断的在提高。到去年7月，甚至能够做到直接利用活细胞来进行衍射实验，从而保证获得在完全天然的生理条件下的蛋白晶体结构。 * * * 蛋白质结构的检测方法 * * 主要内容 蛋白质结构和功能的关系 结构检测方法 优缺对比 * 蛋白质结构和功能的关系 蛋白质是生命活动的主要承担者，在生命体内执行复杂的生物学功能。 蛋白质的结构与功能之间的关系非常密切。 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 一级结构决定了二级、三级等高级结构。 高级空间结构决定了生物学活性和理化性质。 * 蛋白质构象病 蛋白质空间构象的异常变化，如不能折叠或错误折叠，往往导致错误定位而引起疾病，既蛋白质构象病变。其中疯牛病就是蛋白质构象病中的一种。 * 朊病毒 朊病毒又称蛋白质侵染因子、毒朊或感染性蛋白质，是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。 Prusiner S B. A et al protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion[J]. Cell, 1983, 35(1): 57-62. S. B. Prusiner 在1982年发表第一篇文章，第一次提出来该病毒，它与人类的很多疾病发生有密切关系，主要是由于其蛋白质折叠错误。 正常的Prion 致病的Prion * 钾离子通道 Doyle, D.A., et al., The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science, 1998. 280(5360): p. 69-77. 钾离子透过细胞膜的输运行为，对体内或是大脑中神经信号的传导至关重要。然而离子通道的选择性透过行为却困扰了生物学家许多年。 * （1）“多离子透过”的过程：原先通道里有三个钾离子被束缚在里面，只有体积合适的钾离子才能通过撞击，将另一个钾离子从相反方向弹出，而体积较小的纳离子不行。 （2）通道内氨基酸残基的结构，模拟了钾离子在溶液中的水合状态。只有水合的钾离子能够在通道内犹如在水溶液内一样自由地运动。 钾离子通道 * 蛋白质结构检测方法 X射线晶体学 （X-ray Crystallography ） 核磁共振 （Nuclear Magnetic Resonance, NMR） 冷冻电镜 （Cryo Electron Microscope, Cryo-EM） X射线自由电子激光 （X-ray Free Electron Laser, XFEL） * 冷冻电镜（Cryo-EM） 冷冻电镜成像技术是让生物大分子样品快速冷冻，使得水固化形成非晶态的冰，这样可以很好地保持生物样品在活性状态下的原有的结构不被