细胞生物学402精读.ppt

第二章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光镜技术 1、几种常见光学显微镜 A 普通光学显微镜 普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体；③机械装置，用于固定材料和观察方便。 B 暗视野显微镜 使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。 C 相差显微镜（PCM） 1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 应用：观察未经染色的标本和活细胞。 D 倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 E 荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 F 微分干涉差显微镜（DIC显微镜） 能显示细胞结构的三维立体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。 G 激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜） 可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 2 光镜标本的制备 以石蜡切片为例： 材料处理 固定 脱水 包埋 切片 染色 观察 染色剂：普通染色剂，荧光染色剂 3 光镜技术的应用 A 观察活细胞的形态结构，生命运动， 细胞周期。 B 细胞器的定位及功能研究。 C 基因产物与大分子物质的定位及定量。 D 监测细胞代谢活动。 例：胞内钙离子浓度的监测 钙是通用的第三信使，能特异地选择性地调节细胞的活动，因此测定细胞中钙离子浓度在空间和时间上的变化，对于监控许多细胞的生理活动有重要作用。如受精时，卵细胞突然定位地将钙离子释放到胞浆中。 钙指示剂：FuRA－2，水母发光蛋白等 二、电镜技术 1、透射电子显微镜（TEM） 透射电子显微镜以电子束为光源，由于电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短，因而使其分辨力大大提高，目前TEM的分辨力可达0.2nm。 电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 2 扫描电子显微镜（SEM） 扫描电子显微镜（SEM），可用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。 3 扫描透射电子显微镜（STEM） 是唯一不需要染色、固定而能够直接观测单个生物分子的仪器。世界上仅有几台。 4 扫描隧道显微镜（STM） 获1986年诺贝尔物理学奖。 可用来显示晶体表面原子布阵。固态、液态和气态三态 物质均可进行观察，能直接观察生物大分子的原子布阵，也能观察一些生物结构的原子排列，有助于把生物学研究推进到纳米科学水平。 第二节 细胞组分的分析方法 一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 1、差速离心 2、密度梯度离心 1）速度沉降 主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分。