赤潮生物学.pptVIP

分子探针对赤潮生物的检测 姓 名：江晓亮 学 号：1033091023 专 业：水生生物学 Contents 引言 分子检测技术概论 寡核苷酸探针 肽核酸探针 引言 有害赤潮的发生给全球造成了重大的经济损失,对海洋生态环境、资源和公众健康构成了严重威胁，正成为越来越严重的全球性海洋灾害。 如何准确地进行赤潮监测,以便及时采取有效防治和减灾措施,减少赤潮造成的危害和损失。 分子检测技术概论 分子检测技术是以细胞表面或细胞内部的生化标记(蛋白质、DNA、RNA)为作用对象,通过寡核苷酸、抗体、外源凝集素等标记分子探针,检测全细胞或细胞匀浆中的专一性标记结合物质,将标记转换为光信号,用于目标赤潮生物的定性和定量分析。主要有寡核苷酸探针、免疫探针、肽核酸探针（PNA探针）及细胞凝集素探针（lectin探针） 寡核苷酸探针 原理：1、任何赤潮物种都存在着不同的具有各自特异性的基因序列（如DNA或RNA） 2、按照目标生物特征性靶序列的差异可设计单链寡核苷酸探针，这种探针具有高度的专一性和较强的稳定性。 目标序列的获取： 核酸数据库或专门数据库 如：GeneBank、Genome Database、RDP（核糖体数据库）等 特异性引物扩增目的基因 如：核糖体RNA基因、蛋白特异性基因 利用蛋白质或特异性氨基酸数据库 如：一些毒素合成酶基因 操作步骤 藻种的选择和培养、DNA提取及PCR扩增 测序及序列分析 Fig：探针AF 设计所针对的核糖体大亚基区域及其序列信息：其中序列AF是指相关亚历山大藻；序列TA是指塔玛／链状亚历山大藻复合种的亚洲温带核糖体型；序列WE是指塔玛／链状亚历山大藻复合种的西欧核糖体型；序列PO是指微小亚历山大藻的葡萄牙核糖体型；序列NZ是指微小亚历山大藻的新西兰核糖体型 探针的设计 荧光原位杂交 注：上图来自于侯建军的博士论文 荧光显微镜和流式细胞仪检测 应用该技术取得的相关结果 德国学者(John et al，2003）针对能够产生spirolide毒素的亚历山大藻A．ostenfeldii与产PSP毒素的亚历山大藻A．tamarens二种亚历山大藻成功设计了特异性探针 唐祥海，于仁成等人通过设计特异性的寡核苷酸探针，应用荧光原位杂交技术，实现了对塔玛／链状亚历山大藻复合种亚洲温带核糖体型的特异性标记和检测 肽核酸探针 肽核酸（PNA）是90年代初期人工合成的DNA类似物，是一类不带电荷，具有类似于肽链骨架结构并携带有碱基的新信息分子 PNA的电中性 热稳定性 盐稳定性 复合物 Tm/℃ 复合物 Tm/℃ 15merPNA/DNA 69 15merRNA/RNA 72 15merDNA/DNA 54 15merDNA/RNA 75 条件：10mmol/L磷酸盐缓冲液，0.1mmol/LEDTA,100mmol/NaCl，pH值7.0 NaCl/(mmol/L) Tm 15℃ PNA/DNA Tm 15℃ DNA/DNA 0 72 38 140 72 56 1000 65 65 条件：15merPNA/15merDNA与15mer互补DNA杂交；10mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.0 注：以上两图表引自何为主编的《肽核酸》 原理：LightUp探针和LightSpeed探针为两种荧光标记的PNA探针。当未与靶序列结合的时候，两者都不发荧光；与靶序列发生结合的时候，其荧光基团暴露出来。因此省去了杂交后除去游离探针的分离和洗涤步骤。 PNA探针的种类及工作原理示意图 操作步骤 藻种的选择和培养、DNA提取及PCR扩增 测序及序列分析 探针的设计及合成 荧光原位杂交（FISH）或膜杂交 荧光显微镜或流式细胞仪检测 应用该技术取得的相关结果 侯建军等人用阳性PNA探针与阴性PNA探针和空白对照组相比，分别对单种T.pulchellum进行标记，发现他们呈现出完全不同的荧光，说明 侯建军等人利用设计的PNATP28S01探针均能在混合样品中，将目标藻T.pulchellum识别出来，而不会和其他藻发生显著的交叉反应