1绪论-3酶分离纯化-2解析.ppt

第五节 酶的分离纯化 一 细胞破碎 二 酶的提取 三 离心分离 四 过滤与膜分离 五 沉淀分离 六 层析分离(link) 七 电泳分离(link) 八 萃取分离 (link) 九 酶的结晶(link) 十 浓缩与干燥(link) 六 层析分离 是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离。 层析分离中一个相是固定的,称为固定相; 另一个相是流动的,称为流动相; 各组分移动速度步同,使不同组分分纯化; 层析分离设备简单,操作容易; 表4-5 层析分离方法 一、吸附层析(link) 二、分配层析(link) 三、离子交换层析(link) 四、凝胶层析(link) 五、亲和层析(link) 附：视频动画 1、色谱柱 2、液相色谱 一、吸附层析 一个相中的物质在两相界面上密集现象称为吸附； 吸附产生原因：固体表面分子与固体内部分子受的作用力不同；主要是范德华力。 常用于酶分离纯化的：硅藻土、氯化铝、磷酸钙、羟基磷灰石、活性碳。 不同物质吸附力、解析力不同，移动距离不同，而分离。 ２、洗脱方法 （１）溶剂洗脱法 吸附层析（续） （３）前缘洗脱法 ３、吸附剂与洗脱剂的选择 （１）吸附剂的选择 极性物易被极性表面吸附；溶解度大的越难吸附；吸附剂分无机和有机吸附；用于酶分离纯化的有硅藻土、氧化铝等，在低pH值、低离子强度下对酶有较强吸附作用，提高难度pH，离子强度即可洗脱。 （２）洗脱剂的选择 对于极性组分用极性大的溶液； 注意点：洗脱剂不与吸附剂反应、对各组分溶解度大、流动性好，有一定纯度。 二、分配层析 分配系数指溶质在两互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两溶剂中浓度比值。 通常用一种多孔性固体支持物吸着一种溶剂为固定相。 不同溶质有不同分配系数，移动速度不同，从而分离。 （１）纸上层析 　滤纸为支持物，以滤纸纤维结合水为固定相，有机相为流动相，分配系数不同而分离。 （２）薄层层析 　固定相支持物铺在支持板上成为薄层，有吸附薄层层析，分配薄层层析。 三、离子交换层析 利用离子交换上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。 酶是两性物质，当溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。 用于酶分离纯化的常用离子交换剂 离子交换树脂：大孔径离子交换树脂。 离子交换纤维素：DEAE-纤维素，AE-纤维素，CMC（羧甲基纤维素） 离子交换凝胶：DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶等。 四、凝胶层析 混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 凝胶层析是60年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。 从广义上说凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的高分子聚合物，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。制成颗粒状，装进凝胶层析柱使用。 设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于不同分子量的各种物质。 １、凝胶层析的基本原理 凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱; 分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，最后流出柱外。 整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。 Kd：分配系数，Kd小的物质先流出。 Ve：冼脱体积，表示某一组分从进入导析柱到流出 液中出现该组分高峰时，所需的冼脱液的体积。 Vo：外体积。层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积 Vi：内体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。 凝胶层析的基本原理（续） 大分子小分子在凝胶内流动速度差异理论： （１）流动分离理论 （２）扩散理论 组分冼脱体积与相对分子量（Ｍ）关系： 1、葡聚糖凝胶：以葡聚糖为单体聚合而成的高分子聚合物。商品名为Sephader，从G-10到G-200共有8种型号。 2、琼脂糖凝胶：商品名为Sepharose（瑞典）Bib-gel A（美国）Gelarose（丹麦）。 3、聚丙烯酰胺凝胶：商品名为Bio-gel P。 加入的酶液量为凝胶床体积的10%左右， 不超过30%； 冼脱液体积为凝胶床体积的120%左右； 冼脱液与干胶溶涨和装柱平衡用液相同。 五、亲和层析 利用生物分