不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冻存和复苏的影响.docVIP

不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冻存和复苏的影响 ( 1. 广东广州 510631；2. 华南师范大学生命科学学院2011级生物科学2班) 摘要：以小鼠胎儿的成纤维细胞为实验材料,以不同冷冻保护剂（10%DMSO、10%EG、10%GL、5%DMSO+5%EG、5%DMSO+5%GL）和不同浓度的血清（10%、20%、30%）组合,冻存和复苏小鼠胎儿成纤维细胞,观察贴壁情况和测定细胞存活率,以研究不同冷冻保护液对小鼠胎儿成纤维冻存和复苏.实验结果表明:①同一冷冻保护剂剂对细胞的冷冻保护效果随着血清浓度的增加而增强（10%GL除外）;②5%DMSO+5%EG+30%FCS的冷冻保护效果最好. 关键词：冷冻保护剂；血清浓度；冷冻保存；成纤维细胞；生理特性 1 引言 成纤维细胞具有较强的分裂增生能力，适应性强且性状稳定，是研究动物克隆最常用的细胞类型。对于ES细胞的分离和克隆而言,成纤维细胞冷冻保存能随时提供饲养层而不受胎儿、睾丸或其它实验材料不足的限制［1］。但是，体外培养的细胞，随着传代次数的增加，细胞各种生物学特征会逐渐发生变化，同时，长期传代也会造成资源浪费。细胞冷冻在超低温(-196℃)环境之下,其代谢活动几乎停止,解冻复苏之后又能恢复正常的生理活动。因此，在细胞传代过程中，需要适时进行细胞冷冻保存，以保证体外培养细胞的质量，又便于取用。 细胞若在不加低温保护剂而直接进行冻存，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞发生一系列的变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等等，最终导致死亡。因此需要使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。常用的冷冻保护剂主要包括二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甘油（GL )。使用不同冷冻保护剂，冻存和复苏效果存在差异，因此探究不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冻存和复苏的影响，以便于更好保存细胞，具有重大意义。 2 材料与方法 2.1 材料与仪器 材料：对数生长期的小白鼠成纤维细胞 试剂：消化液；洗涤液；培养液；0.4%台盼兰；冷冻保护剂（10%DMSO、10%GL、10%EG、 5%DMSO+GL、5%DMSO+GL）10%、20%、30%FCS. 器具：超净工作台、CO2培养箱、离心机、废液缸、倒置显微镜、低温冰箱、酒精灯、 吸管、移液枪、泡沫小盒、搪瓷罐、离心管、细胞冻存管、 血细胞计数板 2.2 实验方法 2.2.1 细胞冷冻保存 取出对数生长期的小白鼠成纤维细胞，吸去培养液；加入消化液2~3ml，消化2~5min后去除消化液，加入洗涤液约5ml，吹打、分散细胞；平衡后，放入离心机离心5min(2500r/min)，弃去上清液，加入冷冻保护剂2ml，吹散细胞；分装入冷冻管，做好标签，用棉花包裹好冷冻管，放至泡沫小盒，放入-70℃超低温冰箱保存。 2.2.2 细胞复苏 用长镊从超低温冰箱中取出细胞冻存管，立即投入盛有38℃温水的搪瓷灌或不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，尽快解冻；从37℃水浴中取出冻存管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并洗涤液至10ml，混合后2500转/min离心5min，弃上清；细胞沉淀中加入培养液5－6ml?，置37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，观察细胞生长情况。 2.2.3 细胞活力测定和计数 在1.5mlEP管中将100?μL?细胞悬液与100μL?0.4%台盼兰溶液混合，染色2-3分钟；将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上；加样前，先将细胞悬液充分混合均匀，吸出少许（10μL),滴加在盖玻片与计数室平台交界处，利用毛细作用将样液吸入计数室。 镜下观察，死细胞被染成蓝色，活细胞呈无色透明状。计算计数板上四个大格细胞的死细胞和活细胞数，计算细胞浓度和存活率。 细胞存活率（%）=（活细胞数/总细胞数）×100% 细胞浓度（个/ml）=（4大格细胞数之和/4）×104 ×2 3 结果与分析 3.1 不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻效果的影响 在同一血清浓度下，以10%DMSO、10%EG、10%GL、5%DMSO+5%EG、5%DMSO+5%GL作为冷冻保护剂冻存小鼠胎儿成纤维细胞，复苏后观察贴壁情况，测定细胞存活率。由表1（横向比较）和图1（10%FCS为蓝色条柱，20%FCS为紫色条柱，30%FCS为黄色条柱）可见： 当血清浓度为10%时，10%DMSO、10%EG、10%GL、5%DMSO+5%EG、5%DMSO+5%GL五种冷冻保护剂的细胞存活率由大到小为：5%DMSO+5%EG(69.71%)10%EG(66.89%)10%DMSO(58.63%)5%D