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利用优势微生物抑制烟时霉变的研究 朱大恒　韩锦峰 郑州烟草研究院　郑州　450000　河南农业大学 摘要：试验研究了烟叶优势微生物对烟叶霉变的抑制作用。利用从烟叶中分离、纯化、培养出的优势微生物菌种对烟叶进行了抑霉试验。结果表明：从烤烟（C3F）中分离、筛选出5株优势微生物（M1、M2、M3、M4、M5）对培养基、烟丝和烟叶中霉菌的生长繁殖均有不同程度的抑制作用，以Ml菌株的抑霉作用最为显著。试验还对Ml菌株的生理生化特性进行了分析鉴定。这一研究结果为利用生物技术抑制烟叶霉变开辟了新途径。 　　关键词：烟叶　优势微生物　霉变　抑制 　　在烟叶仓储损耗中烟叶霉变占着很大的比例，造成的损失十分严重。烟叶在霉变过程中，霉菌分解烟叶成分，引起不利的物理和化学变化，使烟叶产生霉腐臭气，霉坏变质，严重影响烟叶的外观品质和香味品质，降低烟叶的使用价值。因此，防治烟叶霉变是一项极为重要的工作。 　　目前，在防治烟叶霉变方面的技术措施主要有控制烟叶入库水分含量、控制仓库空气相对湿度、定期翻垛、密封降氧、仓库喷洒化学药剂消毒、改善烟叶包装条件等。这些措施虽然对减少烟叶霉变起到一定作用，但在实际生产中，很难达到的理想的仓储环境条件，烟叶中的霉菌一旦遇到适宜的温湿度条件，烟叶就会发生霉变，并迅速蔓延。因此，尽管烟厂投入了大量的人力、物力和资金，烟叶霉变现象仍不能得到控制，仍然是目前各烟厂烟叶仓储中普遍存在的一大难题，亟待进一步研究和解决。 　　本文针对上述问题，首次提出了利用优势微生物抑制烟叶霉变的方法，旨在为有效防止仓储烟叶霉变，减少实际生产中人力、物力、资金消耗，减少经济损失开辟新途径；同时，为生物技术在烟叶仓储中的合理运用奠定理论基础。 1　材料和方法 1．1　材料 　　选用河南C3F等级烤烟，品种NC89 1．2　试验方法 1.2.1　培养基类型　（1）查氏培养基：NaNO3 0.2％K2HPO4 0.1％；KCl 0.05％；MgSO4 0.05％；FeSO4 0.00l％；葡萄糖2.0％；琼脂1.5％。用于霉菌分离和纯化。（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3％；蛋白胨10％；NaCl 0.5％；琼脂1.5％。用于优势菌分离和纯化。（3）豆芽汁葡葡糖琼脂培养基：新鲜豆芽：100g于烧杯中加水100mL，煮约半小时后过滤，加入50g葡萄糖、15g琼指。用于抑霉试验。 1.2.2　微生物分离、纯化、计数方法采用常规方法。 1.2.3　防霉试验　（1）培养基防霉试验：将分离、纯化的优势微生物分别接种在豆芽汁培养基上（设3个重复），于30℃培养24小时，待长出菌带后，于菌带外缘处采用划线法接种分离出来的霉菌，培养48小时后，以霉菌菌落外缘至优势菌菌带外缘的距离判断优势菌抑制霉菌的作用大小，筛选出的5株对霉菌抑制作用较强的菌株，代号M1、M2、M3、M4、M5，并对Ml进行形态和生理生化特性分析鉴定。（2）烟丝防霉试验：分别将筛选出的5株优势菌制成菌液（含菌量为106～107个／mL，以10％的用量均匀喷洒在烟丝上，对照以等量蒸馏水代替，然后于95％相对湿度、30℃条件下培养，分别培养2天、4天、6天观察烟丝霉变情况。（3）烟叶防霉试验：将筛选出的5株优势菌制成混合菌液（含菌量为107～108个／mL），以2％的用量均匀喷洒烟叶上，对照以等量蒸馏水代替，烟叶打包后于相对湿度为80％左右、温度为15～30℃条件下存放半年，然后观察烟叶霉变情况，并测定烟叶霉菌数量。 2　结果与讨论 2．1　优势微生物对培养基中霉菌的抑制作用 　　通过大量的分离、筛选试验，从烤烟叶面微生物中选出了5株对霉菌有较明显抑制作用的优势菌株，分别为M1、M2、M3、M4、M5，它们对培养基中不同霉菌的抑制作用见表1。从表1可以看出，M2、M4和M5对黄曲霉有较强抑制作用；M1、M2、M3、M4、M5对黑曲霉有较强抑制作用；而M1和M5对灰绿曲霉有较强抑制作用。综合来看，M1和M5对霉菌的综合抑制作用较大。对M1的形态和生物生化特性进行了分析鉴定，结果列于表2。 表1　优势菌株对培养基霉菌的抑制作用 供试霉菌 菌带间距（mm） M1 M2 M3 M4 M5 黄曲霉 2～5 ＞5 ＜1 ＞5 ＞5 黑曲霉 ＞5 ＞5 2～5 ＞5 ＞5 灰绿曲霉 ＞5 ＜l ＜1 ＜1 ＞5 项目 结果 项目 结果 宽（mm） 0.7～0.8 酪素分解 ＋ 长（mm） 1.5～3.5 酪氨酸分解 ＋ 革兰氏反应 ＋ 厌氧琼脂生长 － 形态 杆状 pH5.7生长 ＋ 形成芽孢 ＋ 5％NaCl生长 ＋ 芽孢位置 中生－亚端生 7％NaCl生长 ＋ 芽孢膨大 － 10％NaCl生长 － 圆形芽孢 － 最高生长温度 50℃ 颜色 乳白色 M-R反应 － 透明度 不透明 V