分光光度法测定蛋白酶酶活.docVIP

分光光度法测定蛋白酶酶活 适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 仪器和设备 分析天平：精度为0.0001g。 紫外分光光度计。 恒温水浴锅：精度±0.2℃。 PH计：精度为0.01PH单位。 试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 缓冲溶液 磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 10g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 分析步骤 标准曲线的绘制 L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1 管?号酪氨酸标准溶液的浓度g/mL） 取100ugmL酪氨酸标准溶液的体积 mL取水的体积 mL 固体样品的酶活力换算按式（2）计算： （2） 式中： —固体样品的酶活力，(u/g)； —固体样品溶解定容后的酶活力，(u/mL)； —样品定容体积，ml； —称取样品的质量，g； 所得结果表示至整数。 检验注意事项 缓冲溶液配制注意事项 缓冲溶液配制完成后，用PH计测定其PH值，若PH值不在规定范围内，需用相应的试剂调PH值至规定要求。 多个样品同时检验注意事项 如果有多个样品进行检测，样品处理过程： 预热→加酶液→保温→加三氯乙酸→沸水煮沸 ，需要分别单独进行操作和计时，加酶液及试剂的时间控制在1min以内。 附则：本方法自20年月日实施。 本方法的编制与修订属于质量管理部。 编制人：审核人：批准人： RS/TN/ZL-004 分光光度法测定蛋白酶酶活 版号/修改：A/0 共 5页 第 4 页 RS/TN/ZL-004 分光光度法测定