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自由Cu点击化学 在19世纪后期，Michael 第一个发现了叠氮化合物和炔烃的环加成反应生成三唑化合物，在20世纪中期，Hulsgen花了大量的时间分析环加成反应的机理，产生了物理有机化学科目分支，可以把这个反应转变成正交反应。与斯陶丁格连接反应一样的是，环加成反应最大的不足之处, 用传统未活化的炔烃反应，反应的动力学很弱，需要很高的温度和压力, Hulsgen反应确实需要高温高压，但是这远远超过了生物系统所承受的极限。 在21世纪初期，Sharpless and Meldal注意到了Huisgen环加成反应可以作为一种得到一对选择性高功能分子，他们独立发表了通过Cu作为催化剂可以大大提高末端炔烃的反应速率。今天，这个反应被作为Cu点击化学一个典型反应，已经被使用在很多的领域，包括生物化学，它也是正交反应，主要不好的是Cu具有生物毒性。已经有几个实验室致力于减少Cu的毒性，或者经过配基优化增加催化剂的相关性，最近已经成功实现了叠氮化合物与末端炔烃的反应在活生物体中反应。 我们一直追求避免使用金属催化剂，希望通过采矿业的经典机械理论发现一种对生物友好的叠氮化合物与炔烃的反应。在1961年Wittig and Krebs报道了环辛炔是一种最不稳定的炔烃，和苯基叠氮化合物反应像爆炸一样。我们可以推断出在环辛炔与环加成反应中有18cal/mol的热量释放。 通过一个假定的Cu自由点击化学，我们可以合成一些可以作为生物探针功能的环辛炔，在图8A中的OCT化合物可以与生物素连接进行生物标记的研究。线性炔烃本质上不会与叠氮化合物反应在生理温度的条件下。但是，OCT-biotion 能很容易与标记了多糖的叠氮化合物反应在细胞的溶解产物中。在图8B C中，化合物没有表现出明显的毒性，与Cu作为催化剂完全相反，然而，在模型反应中的二阶速率常数0.0024/ms，OCT没有比斯陶丁格反应更快，并且化合物水溶性也有限。 我们着手通过分子改造加快反应速率和提高物理性能为了应用于活体成像。“aryl-lessoctyne” 13 (ALO)有很好的水溶性，但是反应动力学性能与OCT差不多。通过在丙炔位置加入吸电子的F原子得到一氟化环辛炔MOFO(14)反应速率得到大大的提高。MOFO证明比OCT和ALO的反应都要快，因此，标记的叠氮化合物在细胞溶解物和细胞表面都很快。在丙炔位置加入两个F得到二氟化环辛炔DIFO（15），能增加Cu自由点击化学反应速率几个数量级。Boons和他的同事后来报道了通过连接两个芳基环到环辛炔中心，也能得到相同的速率提高。我们也能添加一个酰胺键到DIBO速率也能提高一个数量级，得到BARAC（17）k=0.96/ms。在BARAC的环外加个氨基化合物得到18DIBAC,并且它和叠氮化合物 的速率常数0.31/ms，另外，DIBO的其他形式也报道过如（19、20），也有Keto-DIBO经过光谱的改变在与叠氮化合物生成三唑化合物。这些不同的环辛炔反映了在模糊的化学反应的形成过程分子改造的机理从20世纪中期进入高效的生物正交反应时代。 环辛炔和叠氮化合物反应的二阶速率常数确实反映了环辛炔探测生物体内叠氮化合物的能力。正如图10A中，DIFO试剂化学标记细胞表面叠氮化合物比磷化氢试剂敏感的多，而且，DIFO，DIBO,和BARAC的细胞表面的标记效率跟相关反应一致（图10B），所有的三种环辛炔都连接了F在活细胞中也叠氮化合物多糖成像（图11），BARAC反应速率的提高能够低浓度探针成像而不需要通过冲洗步骤来去除多余的探针。 化学正交反应的第一个运用活体中成像可以通过使用DIFO与叠氮化合物的反应得到，我们利用DIFO-Alexa Fluor 连接物（DIFO-488，DIFO-555,）去探测在线虫和斑马鱼中细胞表面的糖基化的时空上的改变。用Ac4GalNAz作为新城代谢的标记，线虫发展三个阶段的糖蛋白成像。在咽部、生殖器、肛门等部位可以观察到明显的标记（图12A），用相同的方式，GALNAZ标记的糖蛋白在斑马鱼的胚胎中成像在60到73h受精后。动态标记也能检测到在鱼蓟、额中，受精后的多糖变化通过脉冲追踪实验观察到（图12B）多糖的表达在斑马鱼胚胎早期能被探测到通过在显微镜下直接注射GalNAZ和UDP-GalNAz 进入单个细胞胚胎的蛋黄中。用这个技术，叠氮化合物多糖能够在受精后7h成像。（图12C） 老鼠是一个很好的模型研究人类疾病，特别是癌症。因此我们一直使用DIFO探针在活体中成像。然而，DIFO和叠氮化合物快速的反应动力学没有能够在小鼠体内实现。的确，与磷酸氢进行比较，DIFO试剂与叠氮化合物多糖反应效果不是很明显在小鼠淋