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生物化学综合实验习题解答 综合实验一 蛋白质的浓度测定—Bradford法1．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？ 答： 1 由于蛋白与考马斯亮蓝G-250染料的结合能力不同，纵向倒转混合，充分反应。 2 标准蛋白加入的量与考马斯亮蓝G-250的体积相差悬殊，纵向倒转混合，充分反应。 2．查阅相关资料、文献，举例说明测定蛋白质的浓度的方法有哪几种，并说明各自的优缺点。 答：主要的以下几种： （1）微量凯氏（Kjeldahl）定氮法，优点是测定准确率高，可测定不同形态的样品。 缺点是测定过程繁琐。 （2）双缩脲法（Biuret法） e. I% S3 K; R |4 H% Q优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。　 （３）Folin—酚试剂法（Lowry法） 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 ４）考马斯亮兰法（Bradford法）5 g* M. h4 Z+ d9 F- H6 Z! c6 8 M$ s# Y ~ _4 P1 U; i; E? ? 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。4 S: B5 ! w0 b+ |1 y在波长为595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 优点：a. 灵敏度高。　b 测定快速、简便，只需加一种试剂。c. 干扰物质少。 缺点： a ; x3 p* N H; A/ \ ^2 N, P0 iaaaaa 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。b.物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。c. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 综合实验二 （1）酸性磷酸酯酶的提取1、酸性磷酸酯酶在生物体内的作用是什么？ 答：酸性磷酸酯酶 Acid Phosphatase，E.C.3.1.3.2 存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键，如水解磷酸苯二钠生成苯酚和无机磷。 综合实验二 （2）酶促反应进程曲线的制作和初速度的测定1、为什么酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行？ 答：要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应时间延长以后底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶反应时间成正比这一段时间内进行初速度的测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。 综合实验二 3 酶的活力测定1、酶活力测定中为什么各样品与底物测定的时间要严格一致？ 答：本实验中用磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解以后即生成酚和无机磷，其反应式如下： O || C6H6-O-P-ONa + H2O ≒ C6H6-OH + Na2HPO4 | ONa 由上式可见，当有足够量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。反应速率只在反应的最初一段时间范围内保持恒定。随着时间的延长，底物浓度的降低和产物浓度的升高，使逆反应加强。 综合实验二 4 酸性磷酸酯酶分子量的测定SDS电泳法1、为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的甘油溶液？甘油及溴酚兰的作用分别是什么？ 答：加少许溴酚兰的目的是作指示剂，用来反映在电泳的过程中样品蛋白质迁移的长度。加入甘油的作用是甘油的密度较大，对样品中的蛋白质起沉淀作用。 2、影响迁移率的因素有哪些？ 答：①SDS的浓度，溶液中的SDS的总量至少要比蛋白质的量要高三倍，一般高达10倍以上。 ②溶液的离子强度，溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，在低离子浓度中SDS单体具有较高的平衡浓度。 ③二硫键是否完全被还原，只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的条件下