混合酶消化法检验溺死脏器硅藻的实验性研究【参考】.docVIP

混合酶消化法检验溺死脏器硅藻的实验性研究 【摘要】? 目的? 探讨利用混合酶消化法从溺死者肺、肝、肾、脾等脏器中检出硅藻，为区别生前溺水死亡或死后抛尸入水提供科学依据。方法? 通过动物实验制作溺死脏器样本，通过单一酶消化选出几种消化能力强、价格便宜的酶，将几种酶按比例混合进行脏器消化。同时进行强酸化学消化法对比。结果? 肺脏的最佳消化组合酶为胶原酶Ⅰ、蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；肝脏的最佳消化组合酶为胶原酶Ⅱ、蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；肾脏的最佳消化组合酶为蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；脾脏的最佳消化组合酶为胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、蛋白酶K和透明质酸酶。结论? 混合酶消化法检验溺死脏器中硅藻在速度、安全性、环保、检出率等方面均优于强酸消化法，应在公安刑事科学技术范围内推广使用。??? ??? 【关键词】? 混合酶；消化；硅藻；溺死??? 在溺死案例中，硅藻随溺液进入肺泡内，并通过肺泡壁毛细血管进入大循环，到达全身各器官。检查脏器中的硅藻，是诊断生前溺水死亡较为可靠的方法。对溺死尸体进行硅藻检验大约始于19世纪末，至今已有一百多年的历史［1］。1904年，Revenstorf［2］首次报道了依据硅藻检验方法诊断溺死的案例。近几十年来，很多学者对硅藻的检验方法进行了探索和创新，但各种方法均有不足之处。目前普遍采用的是用化学（强酸、强碱）消化法进行检验，该方法危险性高，安全性差，对环境污染大，操作复杂，检出率较低。本项研究对实验性溺死大鼠脏器中的硅藻进行混合酶消化法检验，针对脏器中组成成分所占比例不同，选择不同的组合酶来进行消化。经过反复摸索和实践，最终确定了该方法的操作规程。此硅藻检验新方法的确立，大大提高硅藻的检出率和硅藻种类的检出范围。??? ??? 1? 材料与方法??? 1.1? 实验动物? 中国医科大学动物部提供的成年健康清洁级SD大鼠20只，雌雄不限，平均体重300±15g，适应性饲养3天。室温：25±2℃，湿度：(30±2)％。??? 1.2? 主要仪器和试剂? 常用仪器为离心机、恒温箱、显微镜和破机罐等。试剂选用了胃蛋白酶（上海化学试剂公司）、胰蛋白酶（美国Difco）、蛋白酶K（德国Merck）、胶原酶/分散酶（美国Roche）、胶原酶I、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶（美国Roche）和糜蛋白酶（上海化学试剂站分装厂）等。??? 1.3? 实验方法??? 1.3.1? 动物分组? 随机分成4组，预试验组8只（A组），溺死于含已知硅藻种类的水中，溺死过程为5min；正常对照组4只（B组），断颈处死；实验组对照组4只（C组），断颈处死后投入含已知硅藻种类的水中；实验溺死组4只（D组），溺死于含硅藻土的水中，溺死过程为5min。??? ??? 1.3.2? 操作步骤? 分别取各种脏器1g剪碎后置于10ml试管中，加入TES［取2M Tris-HCl（pH=7.5） 5ml，0.5M EDTA 10ml，5M NaCl 20ml，加灭菌蒸馏水1000ml。终浓度：10mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA］缓冲液3ml、SDS(十二烷基硫酸钠，10%)溶液0.3ml和选用的酶溶液200μl，置45℃恒温箱内观察3～6h，待液体近透明（无明显固体）时，加入3ml蒸馏水，混匀后离心、去上清涂片镜检。??? ??? 1.3.3? 强酸消化法? 取B组、C组和D组大鼠的肺脏、肝脏、肾脏及脾脏等脏器，按文献报道所示步骤进行消化［2］。??? ??? 1.3.4? 酶选择实验? 笔者应用了市面上常见且价格合理的8种生物酶进行了选择性试验，取A组大鼠的各种脏器，剪碎后分别加入有标记的试管中，每只试管加入一种酶（浓度暂定为20mg/ml），按1.3.2所示步骤进行消化。??? ??? 1.3.5? 消化灵敏度实验? 按1.3.4步骤将选择后酶的浓度分成40mg/ml、20 mg/ml、10 mg/ml和5 mg/ml，取A组大鼠的肝脏、肺脏、脾脏及肾脏，按1.3.2所示步骤进行消化。??? ??? 1.3.6? 酶组合消化脏器试验? 取B组、C组和D组大鼠的肝脏、肺脏、脾脏及肾脏等，根据1.3.4和1.3.5的结果选择几种酶类配制一定浓度后按1.3.2所示步骤进行消化。??? ??? 2? 结果??? ??? 通过肉眼观察，将各种酶的消化能力分成4级，分别用罗马数字Ⅰ～Ⅳ级表示。Ⅰ级表示消化能力最强，Ⅳ级表示消化能力最弱，具体意义如下：Ⅰ级：液体中可见少许固体物质，约10％；Ⅱ级：液体中剩约25％的固体物质；Ⅲ级：液体中剩约50％的固体物质；Ⅳ级：液体中剩约75％的固体物质。??? ??? 2.1? 酶选择试验? 见表1。从表1中可以看出：(1)肺：胰蛋白酶、蛋白酶K