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中国协和医科大学博士学位论文p53-HDM2相互作用的非肽小分子抑制剂syl-155对肿瘤细胞的毒 性作用姓名：李文东申请学位级别：博士专业：@指导教师：刘芝国协和医科大学博士研究生学位论文作者:李文东导师:刘芝华中国协和医科大学p53–HDM2 相互作用的非肽小分子抑制剂 syl-155 对肿瘤细胞的毒性作用中文摘要p53 是一个强力抗肿瘤活性的抑癌蛋白。在许多人类肿瘤， p53 被失活，有多种机制参与失活 p53。其中一个机制是癌蛋白 MDM2（在人为 HDM2）与 之结合，并将其降解。在p53 和MDM2 蛋白之间形成一个负反馈调节环。5%-10%的人类肿瘤中HDM2 蛋白过表达使p53 失活。通过抑制肿瘤细胞中p53 与MDM2的相互作用进而激活 p53 蛋白功能已成为寻找癌症药物治疗的热点。已有多个研究从不同的方面证实了这种方法的可行性，这些研究包括：显微注射单克隆抗 体，反义寡核苷酸转染，表达 p53 肽类似物或融合蛋白，以及微生物提取物等。然而，除反义寡核苷酸外，它们都是肽类或大分子物质，成本较高，不利于新药 开发和应用。因而，发展非肽类小分子 MDM2 拮抗剂就成为一个方向。基于 p53-HDM2 蛋白复合物晶体结构的阐明，我们与医科院药物所尹大力教授合作，利用计算机辅助模型设计并用化学方法合成了一系列非肽小分子的HDM2 抑制剂，我室已毕业的赵剑华博士采用 ELISA 方法评价了它们与 MDM2的亲和性，其中一部分能从 p53 与 MDM2 的相互作用中释放 p53，诱导肿瘤细 胞凋亡。本研究评价了赵剑华博士尚未研究的非肽类小分子的 HDM2 抑制剂。 采用 MTT 法，获得它们在 5 种不同肿瘤细胞的 IC50，以 IC5010μg/mL 作为筛 查标准，最后确定 syl-155 进一步研究。采用 MTT 法、蛋白印迹和流式细胞分 析检测了 syl-155 对三种不同 p53 状态肿瘤细胞的影响：KYSE510（人食管鳞 癌细胞系）（突变型 p53）、HT1080（人纤维肉瘤细胞系）（野生型 p53）、MG63（人骨肉瘤细胞系）（p53 缺失）。结果发现，syl-155 仅在表达野生型 p53 的 HT1080 细胞中刺激 p53 和 p21 的积聚，进而诱导细胞 G1期阻滞或凋亡；而在表达突变型 p53 的 KYSE510 和 p53 缺失的 MG63 中则没有观察到这些影响。 因此，我们可以得出这样的结论：非肽类小分子 HDM2 抑制剂可能用于表达野 生型 p53 肿瘤的治疗。关键词：p53；HDM2；抑制剂1中国协和医科大学博士研究生学位论文AbstractThe tumour suppressor p53 is a transcription factor with powerful antitumor activity that is controlled by its negative regulator MDM2 (mouse double minute 2, also termed HDM2 in humans) through a feedback mechanism. MDM2 protein regulates the activity of p53 protein in at least three different ways. First, MDM2 inhibits the transcription activity of p53 protein by binding to its transactivation domain. Second, MDM2 protein modulates nucleo-cytoplasmic shuffling of p53 protein as a shuffle protein. Third, it promotes the degradation of p53 protein as an E3 ubiquitin ligase. Hdm2 overexpression inactivates p53 protein in 5%-10% of human cancers. Activation of p53 in tumor cells by inhibiting its physical interaction with HDM2 has been in the focus of cancer drug discovery.p53-MDM2 binding involves the interaction of three critical amino-acid residues from p53 with a w