毕业设计论文_大学 hiv1 tat386151n55n碱性区突变体库的构建及亲和筛选.docVIP

硕士学位论文 HIV-1 Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建及亲和筛选 and Affinity Screening 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文使用授权书声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日目 录 中文摘要 1 ABSTRACT 5 缩略词表 10 前 言 11 第一部分 HIV-1 Tat(38-61)融合蛋白的表达及免疫原性分析 13 1. 实验材料 15 2. 实验方法 20 3. 实验结果 23 4. 讨 论 27 第二部分 HIV-1 tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建 29 1. 实验材料 31 2. 实验方法 33 3. 实验结果 36 4. 讨 论 40 第三部分 HIV-1 Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的亲和筛选 42 1. 实验材料 43 2. 实验方法 43 3. 实验结果 45 4. 讨 论 47 总 结 49 综 述 50 参考文献 55 附 录 个人简历 57 致 谢 58 中文摘要 人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）归属于逆转录病毒科中慢病毒属，主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS），即艾滋病。目前，艾滋病感染已经成为全球所面临的重大公共卫生问题。研制有效的HIV 疫苗是艾滋病防治的重要手段之一。因此，探索HIV疫苗研究的新策略和寻找新的疫苗靶点对疫苗的成功研发显得尤为重要。 病毒RNA的转录。“病毒毒素”JAK/STAT信号导途经激活HHV-8，(Arg-Gly-Asp)与内皮细胞αvβ3和α5β1整合素结合与可溶性炎症因子和血管生成因子协同促进肉瘤Kaposi’s sarcoma,KS）的形成神经细胞钙流诱导巨噬细胞和小胶质细胞表达TGFβ、TNF等神经毒性物质，神经毒作用。 本研究分以下三部分进行： HIV-1 Tat(38-61)融合蛋白的表达及免疫原性分析 功能研究表明Tat蛋白碱性区（49-57aa）介导Tat蛋白穿膜，与Tat细胞外活性密切相关。（49-57aa）-48aa），将Tat的以 根据大肠杆菌偏好密码子优化后的HIV-1型株Tat DNA序列设计引物，用PCR方法合成HIV-1 tat()序列T/A克隆法将其pMD18-T载体进行测序。将tat(38-61)克隆至原核表达载体pET32a，构建其原核表达质粒pET32a-tat()。将表达质粒转入E.coli BL21(DE3)中IPTG诱导表达出相对分子量为的融合蛋白，并用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。用本实验室独立制备的EPTIDE-Tat(1-101) 血清和上海市公共卫生中心提供的HIV阳性血清进行ELISA检测，分析Tat（38-61）融合蛋白的免疫原性。结果显示：①为排除融合蛋白中PET32a分子的干扰，我们选用兔抗Tat(1-101)-PEPTIDE血清鉴定pET32a载体上表达的Tat(38-61)（pET32a载体与pPETTIDE 载体序列无同源性）。结果表明二者呈特异反应且反应强度低于PET32a-Tat(1-101)，与预期相符。②为了彻底排除载体分子PET32a的干扰，我们用HIV阳性血清（含抗Tat单抗，无载体分子干扰）进行鉴定，结果显示表明Tat(38-61)、全长Tat二者与HIV阳性血清有基本一致的特异性反应趋势。以上ELISA测定结果说明Tat(38-61) 较好地保留了Tat 综上所述，我们成功构建并表达出Tat()融合蛋白， HIV-1 tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建 研究表明，碱性区两个重要的位点51K和55R定点突变后，不仅其中和表位未被破坏，且Tat穿膜活性和胞外毒