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第五章 病毒的分离鉴定 病料的采集与保存 病料的处理 接种（鸡胚、实验动物、细胞） 组织培养细胞中病毒增殖的判定 病毒感染力的滴定 免疫学检测 分子生物学检测 病毒理化学特性的测定 病毒分离鉴定的步骤: 病料采集的基本原则 尽量无菌操作，避免细菌污染 尽早采集病料，尽快送检，低温运输 根据动物及病毒的种类不同采集不同的组织病料 同一疾病，不同病程取不同标本 检材容器贴上标签，并在相应化验单详细填写检验目的、标本种类、临床诊断及其他常规项目 采集病料后应尽快冷冻保存 病料采集后的保存 -30℃可保存几个月 -70℃可保存几年 怀疑为疱疹病毒的感染材料，可置-50℃或4℃保存 现场采集病料，应尽快置装有冰–盐混合物的冰瓶内，送往实验室或冷藏地点。 脑、肝、肌肉等器官或组织 病料的处理 充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含青霉素、链霉素各200U/ml）。 反复冻融3次。 2000r/min离心10min。 取上清（过滤后）作接种物。 鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物 用内含1000u/ml青、链霉素（P.S）的Hank’s液，将其稀释3-5倍。 充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜。 2000r/min 10min取上清（过滤）作接种物。 咽喉拭子或鼻拭子 仔细用棉拭子擦拭咽喉部或鼻部。 迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液（200-500u/ml P.S）的试管内，充分涮洗棉拭子。 反复冻融3-5次，收集液体部分。 2000r/min 10min，收集上清（过滤）作接种物。 粪便 无菌的体液或鸡胚液 用棉拭子插入肛门沾取或扑杀病畜后由肠管采集。 用含1000u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀释。 4℃感作4h。 2000r/min 10min取上清（过滤）作接种物。 直接作接种用 本动物：马传贫病毒、猪瘟病毒、鸡瘟病毒 实验动物 鸡胚：正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、脑炎病毒 组织培养细胞 接种方法 病毒增殖的判定 病毒感染力的滴定（TCID50或PFU及对动物的毒力） 病毒的生长曲线 免疫学检测 SNT、HA和HI、LAT、IHA、AGID、ELISA 分子生物学方法 PCR与序列测定、核酸杂交、病毒基因组限制性内切酶图谱 原理：设药物处理组（试验组）与正常不处理组（对照组），分别测定两者的TCID50值（或PFU），以试验组的TCID50比对照组低2个对数以上判为阳性，1-2个对数之间判为可疑，1个对数以上判为阴性。 试验组 对照组 结果判定 TCID50/0.1mL 10-2 10-5 阳性 10-3.5 10-5 可疑 10-4.1 10-5 阴性 病毒理化学特性的测定 主要测定病毒对不同理化因子的敏感性。 药物抑制试验 FUDR （5-氟脱氧尿苷） IUDR （5-碘脱氧尿苷） BrUDR（5-溴脱氧尿苷） 原理：FUDR、IUDR、BrUDR是嘧啶的卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，产生无功能分子，抑制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。 病毒核酸型鉴定 Feulgen染色 用于鉴定细胞内的DNA病毒。 原理：胞核和胞浆内的DNA包涵体呈紫红色团块状。 吖啶橙染色 用于鉴定是单链病毒还是双链病毒。 原理：单链核酸染成火红色，双链核酸染成黄绿色。未感染病毒的细胞的胞核呈黄绿色，核仁呈橘黄色，胞浆呈暗红色。感染双链DNA病毒的细胞的核内，出现黄色荧光样物质的微小丝块，核内包涵体也呈黄绿色。感染单股RNA病毒的细胞内，病毒复制区呈橘红色。 乙醚敏感试验 用终浓度为20%的乙醚处理病毒（ 4℃内作用24h），离心取病毒液；同时设对照。滴定两组病毒的TCID50。 氯仿敏感性试验 用终浓度为4.8%的分析纯氯仿处理病毒（4℃振荡混合10min）。随后离心取病毒液。同时设对照。测定两组病毒的TCID50 。 脂溶剂敏感性试验 脊髓灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒对胰酶有较强的抵抗力 痘病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒易被胰酶灭活 用终浓度为0.5%的胰蛋白酶处理病毒液（37℃ 1h），然后加入灭活犊牛血清8ml终止胰酶的作用。同时设对照。最后滴定两瓶病毒的TCID50。 胰蛋白酶敏感试验 用0.1mol/L HCl将病毒液的pH调至3.0(or 5.0) 37℃水浴或室温中感作2h(or 1h) 用5.6% NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右。 对照组加入等量的培养液同样处理。 测定两者的TCID50。 耐酸性试验