东北白桦COMT1基因克隆及其植物表达载体构建.docVIP

东北白桦COMT1基因克隆及其植物表达载体构建 　　摘要：采用同源克隆法结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆东北白桦（Betula platyphylla）咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（COMT）基因COMT1，测序结果显示东北白桦COMT1 cDNA序列全长 　　1 367 bp（GenBank登录号：KC292201），其中完整编码区长度1 095 bp，编码365个氨基酸。利用Gateway技术分别构建了东北白桦COMT1植物过量表达和反义表达载体。 　　关键词：东北白桦（Betula platyphylla）；咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（COMT）；克隆；载体构建 　　中图分类号：S792.153 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3690-03 　　木质素（Lignin）是酚类多聚体，其在植物体内的含量仅次于纤维素[1，2]。因聚合前单体（香豆醇、松柏醇、芥子醇）不同，木质素可分为紫丁香基木质素（S型木质素）、愈创木基木质素（G型木质素）和对-羟基苯基木质素（H型木质素）3种。裸子植物木质素主要为G型，双子叶植物主要含G型和S型木质素，单子叶植物则含G型、S型和H型木质素[3]。木质素的生物合成分为3个阶段：光合同化产物形成苯丙氨酸，苯丙氨酸代谢生成木质素单体以及单体聚合形成不同类型的木质素。木质素单体合成途径中存在多种代谢关键酶类，如苯丙氨酸氨解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL），阿魏酸-5-羟基化酶（Ferulate 5-hydroxylase，F5H），咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（Caffeic acid-O-methyltransferase，COMT），咖啡酰辅酶-A-O-甲基转移酶（Caffeoyl-CoAO-methyltransferase，CCoAOMT）和肉桂酰CoA还原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）等，该途径也是目前木质素调控研究的重点[4，5]。COMT催化咖啡酸、5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇甲基化分别生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，参与S型木质素的合成，裸子植物中COMT只催化咖啡酸[6]。研究表明COMT是S型木质素合成中的关键酶，而且与G型木质素向S型木质素的转化密切相关[7]。此外，拟南芥comt突变体更容易被细菌和真菌所感染[8]，反义抑制COMT1与CCoAOMT表达均使转基因烟草植株木质素含量下降，且两个基因同时被抑制时下降辐度更大[9，10]。 　　东北白桦（Betula platyphylla）是耐寒、喜光、耐贫瘠的树种，具有生长快、适应性强和用途广泛等特点，是我国北方重要树种之一[11]。然而东北白桦木材存在材性脆、韧性弱和密度较低等问题，对东北白桦材质材性进行遗传改良是目前研究的热点。本研究克隆东北白桦COMT1基因全长序列，构建东北白桦COMT1基因植物过量表达和反义表达载体，以期为东北白桦材质材性的遗传改良奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株与质粒 pENTR/SD/D-TOPO和TOP10感受态细胞购自Invitrogen公司，pMD18-T载体购自TaKaRa公司，pGWB2载体、DH5α和农杆菌感受态为东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室自制。 　　1.1.2 植物材料 3个月苗龄的东北白桦苗种植于东北林业大学实验林场，采集幼嫩叶片用于植物总RNA的提取。 　　1.1.3 主要试剂 pBIOZOL购自博日科技有限公司，LA-Taq DNA聚合酶、DNA Marker、dNTP、RNA LA PCRTM Kit反转录试剂盒及3′-Full Race Kit购于TaKaRa公司，Silica Bead DNA Gel Extraction Kit购自Fermentas公司，质粒小提试剂盒购于Promega公司，Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix购自Invitrogen公司，卡那霉素、潮霉素、庆大霉素、利福平购自Sigma公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 东北白桦总RNA的提取及cDNA的合成 　　将东北白桦材料在液氮中研磨至粉末，用小勺取0.1 g粉末至离心管中，采用pBIOZOL提取总RNA，具体操作步骤详见其说明书，得到的总RNA用适量的无RNase水溶解，采用紫外分光光度计测定RNA浓度与纯度。用RNA LA PCRTM Kit反转录合成第一链cDNA，具体操作参照试剂盒说明书进行。 　　1.2.2 东北白桦COMT1正义和反义片段的克隆 　　TGGTG-3′），以东北白桦总cDNA作模板，PCR扩增出东北白桦COMT1序列核心片