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家蝇肠道益生菌胞外多糖抗氧化活性研究 　　摘要：从家蝇（Musca domestica）体内筛选出两株高产胞外多糖的芽孢杆菌，分别命名为芽孢杆菌xzf1（Bacillus sp.）、芽孢杆菌xzf2（Bacillus sp.）。经多糖分离纯化，芽孢杆菌xzf1产胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）BEPS11、BEPS12，芽孢杆菌xzf2产胞外多糖BEPS21、BEPS22、BEPS23。分别检测其清除1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基、羟自由基、超氧自由基的能力。结果表明，胞外多糖具有很强的清除活性氧自由基的能力，在较低浓度下很多多糖的清除能力都高于维生素C，是一种良好的天然抗氧化剂。该研究可为益生菌胞外多糖应用于实际生产提供一定的理论和方法依据。 　　关键词：肠道益生菌；胞外多糖；活性氧自由基；抗氧化活性；家蝇（Musca domestica） 　　中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）19-4740-04 　　多糖在自然界高等植物、藻类、细菌及动物体内均存在，分布极广。近年来，微生物来源的多糖越来越引起人们的广泛注意[1]。多糖是由多个单糖或单糖衍生物聚合而形成的大分子生物有机物质[2]，是具有生物活性的复杂极性大分子，分子质量比较大，与核酸、蛋白质、脂类并称为构成生命活动的四大基本物质，与维持生命所需的多种生理功能密切相关[3]。微生物胞外多糖是细菌、蓝藻和真菌等微生物在生长代谢过程中产生的对其自身有保护作用的生物高聚物[4-6]，细菌胞外多糖在食品领域、医药领域、石油工业等领域已具有广泛的应用，尤其是细菌胞外多糖因具有抗感染、抗病毒、抗辐射、抗血栓和免疫调节及抑制肿瘤细胞活性等作用而引起重视[7，8]。 　　家蝇（Musca domestica）属昆虫纲双翅目环裂亚目蝇科，是中国大部分地区最常见、数量最多的一种蝇类。由于其生活环境复杂、食物来源恶劣，家蝇的生存能力除与自身体内存在大量抗菌活性物质有关外，与肠道内益生菌也有很大的关系。本研究旨在从家蝇肠道中筛选出产活性物质的益生菌，为活性多糖的筛选另辟一条思路，以获得更多有用的活性物质。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂和仪器 　　试剂：1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）购于Sigma公司，DEAE-Cellulose 52离子交换柱和Sephadex G-1000等试剂均为国产分析纯级。 　　仪器：UV2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），SY-305B发酵罐（上海世远生物设备工程有限公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），YXQ-LS-50G立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实验有限公司医疗设备厂），MA99-2A自动核酸蛋白分离层析仪（上海沪西分析仪器有限公司），Scientz-10N型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技有限公司）。 　　1.2 培养基 　　LB固体培养基[9]。 　　1.3 家蝇肠道产多糖菌的筛选 　　2011年10月在实验室内捕获活力很强的家蝇1只，立即将其浸入75%乙醇中进行体表消毒灭菌1 min，在无菌环境下利用灭菌研钵和石英砂磨碎，加入1 mL无菌生理盐水溶解，随后将其稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5系列梯度，均匀涂布于LB固体培养基表面，每梯度重复10次，在37 ℃倒置培养24 h后，选取黏稠、不易挑取的单克隆菌落划线接种于试管斜面上，4 ℃保存备用。 　　1.4 菌种鉴定 　　从菌落形态和菌体显微形态结构观察鉴定菌属[10]。 　　1.5 菌种培养 　　1.6 多糖提取 　　发酵液经12 000 r/min离心，合并上清液，于50 ℃用旋转蒸发仪浓缩至200 mL， 加入4倍于浓缩液的无水乙醇进行充分搅拌，放入冰箱中低温静置24 h，将沉降物采用差速离心法逐级沉淀获得两种粗多糖沉淀，将分离后的多糖在真空冷冻机中干燥至粉末状。 　　1.7 多糖纯化 　　将上述得到的粗多糖使用DEAE-Cellulose 52离子交换柱分离纯化，利用苯酚硫酸法检测多糖含量，并将其中含量较高的成分收集起来，利用Sephadex G-1000进行分离纯化，苯酚硫酸法和核酸蛋白仪跟踪检测获得组分，冷冻干燥备用[12]。 　　1.8 多糖抗氧化活性的研究 　　1.8.2 超氧自由基的清除[14-19] 应用邻苯三酚自氧化体外模拟化学反应，将1 mL 3 mmol/L的邻苯三酚加入到含不同浓度多糖溶液的pH 8.2 Tris-HCl缓冲液中，在两液混合后10 min内每隔30 s测其在325 nm处的吸光值。以不加多糖的反应液为对照计算多糖对O2-的清除率。维生素C也以同样方法测定其清除率。清除率的