大腸杆菌DH5a感受态的制备,质粒验证.docVIP

大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备，质粒的转化及提取 一 实验目的 了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作技术。 了解和掌握质粒转化的原理和操作步骤。 掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法，以及提取过程中各试剂的作用。 二 实验原理 大肠杆菌感受态细胞制备的原理 感受态是细菌细胞具有的能接受外源DNA的一种特殊生理状态，将正在生长的大肠杆菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，此时的细胞呈现出感受态。 质粒转化原理 在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激可诱导细胞吸收DNA。转化了质粒DNA的大肠杆菌经培养可以使质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的大肠杆菌细胞可以在含有相应抗生素的培养基上涂布生长，而没有转化的细胞则无法生长。 质粒提取原理 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 三 仪器，材料及试剂 仪器：恒温培养箱，离心机，恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，电泳仪，水浴锅等 材料：大肠杆菌DH5α菌株，大肠杆菌BL21菌株，pCMV质粒 试剂：Solution I，Solution II，Solution III，1 mol/L CaCl2，TE缓冲液，70%乙醇，酚：氯仿（1:1）等。 四 实验步骤 1，试剂的准备 Solution I: 1，量取下列溶液，置于1L烧杯中。 1MTris-HCL(pH8.0) 25 mL 0.5 M EDTA(pH8.0) 20 mL 20％Glucose（1.11M） 45 mL dH2O 910 ml 2，高温高压灭菌后，4℃保存。 Solution II：1，量取下列溶液，置于500mL烧杯中。 10％SDS 50mL 2N NaOH 50mL 2，加灭菌水定容至500 mL，充分混匀。 Solution III：1，量取下列溶液，置于500mL烧杯中。 KOAc 147g CH3COOH 57.5 g 2，加入300ml去离子水后搅拌溶解。 3，加去离子水将溶液定容至500。 4，高温高压灭菌后，4℃保存。 LB培养基： 1，称取下列试剂，置于1L烧杯中。 Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g 2，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3，滴加5NNaOH（约0.2ml），调节pH值至7.0。 4，加去离子水将培养基定容至1L。 5，高温高压灭菌后，4℃保存。 10×TE Buffer：1，量取下列溶液，置于1L烧杯中。 1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0） 100ml 500mM EDTA（pH8.0） 20ml 2，向烧杯中加入约800ml去离子水，均匀混合。 3，将溶液定容至1L后，高温高压灭菌。 4，室温保存。 1）从-80℃冰柜中取出一支冻存的大肠杆菌DH5α菌株，在冰块上解冻后，于事先照过紫外的超净台中，用无菌接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上分区划线，将菌种迅速放回-80℃保存。平板做好标记后，于37℃培养约16小时,该细菌菌落在LB