實验十一质粒DNA的提取与纯化.docVIP

实验十一 质粒DNA的提取与纯化一、实验目的与原理质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步：细菌的培养和质粒的扩增，细菌菌体的裂解，质粒DNA的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。二、材料与试剂1、材料：大肠杆菌2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪3、试剂：Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)10 mM EDTA(pH8.0)50 mM葡萄糖高压灭菌，4保存Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用Solution III 5 N KAc pH4.8高压灭菌，4保存3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂三、操作步骤1、细菌繁殖LB培养基，2 ml/20ml，37，200rpm，摇一摇，过夜2、离心10 min，5000 rpm, 4；弃上淸液3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 47、加入1.5 ml异丙醇，-20冰箱内放置15 min8、离心10 min，12000 rpm, 49、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中10、加入40 ul，3 M NaAc11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀12、离心10 min，12000 rpm, 413、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。14、电泳检测提取DNA的质量三、结果与分析超螺旋结构DNA四、注意事项在本实验中，如果不经过RNase处理，在电泳带中，RNA会呈现极亮的带，所以，建议使用RNase处理一下。离心时应注意转速不能太低，太低会导致质粒不纯；也不要太高，否则质粒不易溶解。电泳时应注意电压，电压太高或混有蛋白质杂质时电泳带容易产生偏离和拖尾。在DNA操作中应尽可能轻地操作（尤其是分别加入溶液、溶液轻轻摇），否则质粒容易断裂，从而在观察条带时出现许多杂带。无水乙醇可用于沉淀质粒，如果质粒量比较大的话，一般用异丙醇来沉淀。????整个制备过程一般可分为5个阶段： 材料的选择和预处理 细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离） 提取 纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等） 浓缩、干燥及保存。以上5个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每一阶段截然分开。 ?原料的选择主要依据实验目的。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。二、前处理1、细胞的破碎????材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。反复冻融法冷热变替法超声波法加压破碎法化学及生物化学方法有机溶媒法自溶法酶法细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使