实验十.ppt.pptVIP

实验目的 学习用细胞免疫荧光法观察动物细胞微管。 了解动物细胞内微管的结构特征。 实验原理 微管是细胞骨架的主要结构成分之一，它存在于所有真核生物细胞中。 图1 微管结构 电镜观察到的微管结构(A,B) 以及微管结构示意图(C,D) 细胞内的微管维持细胞形态，固定和支持细胞器的位置。 微管的功能： 能与其它蛋白共同组装成纺锤体、基体、中心粒、鞭毛、纤毛等结构，参与细胞收缩及细胞内物质运输。 微管在细胞的有丝分裂中起重要的作用。 图2 有丝分裂的过程 以微管为靶点的抗肿瘤药物 随着一系列针对微管的抗癌药物开发成功，微管已成为抗肿瘤药物的新靶点。开辟了以微管系统作为靶点筛选抗肿瘤药物的新途径。 抗微管药物 （根据药物对微管蛋白的作用） 通过与β-微管蛋白结合稳定微管，抑制微管解聚，使细胞阻滞于分裂期，并诱导细胞凋亡：紫杉醇（paclitaxel）及其类似物(docetaxel)等 通过与α,β-微管蛋白结合抑制微管的组装，使纺锤体不能形成，从而使细胞分裂停止：生物碱类的秋水仙碱（colchicine）、长春碱（vinblastine） 观察微管可以用电镜和免疫组织化学法。 免疫组织化学法中常用的是细胞免疫荧光法。 细胞免疫荧光法： 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光 抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、 生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。利用抗原 抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。 用抗微管蛋白的抗体（鼠抗人）与细胞一起孵育，该抗体 将与胞质中的微管（抗原）特异结合，然后再加荧光素标记的 二抗（如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗鼠抗体）共同孵育， 二抗与一抗结合可以使微管间接的标上荧光素。 偶联有荧光素的微管在荧光显微镜下用一定的波长激发光 照射，即可以根据荧光显示出微管的形态和分布。 材料和仪器 动物细胞、六孔板、塑料吸管、移液器 PBS、紫杉醇、BSA、小鼠抗人tubulin 、Triton X-100 、FITC标记的二抗 、 Triton X-100 、丙酮、DMSO 荧光显微镜 实验步骤 1. 收集对数生长期细胞接种于6孔培养板中，每孔1.9ml（含4×105细胞）。 2. 培养过夜后，加入2.5μmol·L-1紫杉醇分别处理细胞3h，对照组加入同体积的 RPMI-1640液。 3. 作用相应的时间后，PBS洗2次. 4. 丙酮－20℃固定10min 5. PBS洗2次后置0.5％Triton X-100溶液中10min。 6. 再用PBS洗2次，滴加1%小牛血清(用PBS溶液配)封闭10min。 7. 吸去血清，直接滴加一抗（小鼠抗人tubulin 1:400稀释）(PBS溶液配)，室温 孵育1h。 8. 用含1％Triton X-100的PBS洗，加带有FITC标记的二抗（1:150稀释） (PBS溶液配)，室温孵育45min。再用含1％Triton X-100的PBS洗，制片。 9. 荧光显微镜观察、拍照。 作 业 描述观察到的细胞微管形态，及不同处理的区别 细胞免疫荧光法检测苷甲对K562细胞内微管的影响 图10 细胞免疫荧光法检测土贝母苷甲对K562细胞微管的影响(×400) Control Paclitaxel (2.5μmol/L, 3h) Colchicine (2.5 μmol/L, 3 h) Tubeimoside Ⅰ (20 μmol/L, 3 h) 未经药物作用的K562细胞中绿色的微管呈正常的毛玻璃样分布，从细胞的微管组织中心向细胞外围辐射。 Control Paclitaxel (2.5μmol/L, 3h) 经2.5μmol/L紫杉醇作用K562细胞3h后，细胞内的荧光主要呈两种形式分布。大多数细胞内的微管聚集呈很厚的束状，束状的微管围绕在细胞核周围。少数细胞内的微管聚集呈核状。 返回 Colchicine (2.5 μmol/L, 3 h) 秋水仙碱能抑制微管蛋白聚合成微管。 2.5 μmol/L的秋水仙素处理细胞3h后，细胞内的微管骨架崩溃，细胞内已经无法看到网状的微管结构，荧光在胞浆内各处分布。 返回 Tubeimoside Ⅰ (20 μmol/L, 3 h) 经20 μmol/L苷甲作用细胞3h后，细胞形态发生了改变，荧光开始在细胞内均匀分布，网络样的微管分布模糊。 返回 * 微管是真核细胞所特有且普遍存在的结构 * 由微管蛋白二聚体螺旋盘绕装配成微管的壁，13个二聚体绕一周，为单管。 又可以进一步组装成二