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真菌漆酶工程及其在有机合成中的应用南京师范大学泰州学院青年项目（Q201242）资助 南京师范大学泰州学院青年项目（Q201242）资助 李飞 夏文静 （南京师范大学泰州学院 江苏泰州 225300） 摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于真菌，高等植物及细菌中。由于漆酶反应条件温和并具有广泛的专一性，被认为理想的绿色催化剂。本文综述了通过合理设计和定向改造真菌漆酶及漆酶工程并运用于有机合成领域的研究。 关键词：漆酶；催化剂；有机合成 漆酶是一种含铜的蛋白酶，通过夺取底物一个电子能够催化酚类、多酚类和苯胺氧化，通过电子传递将氧气还原成水。漆酶和漆酶介质体系在生物修复、纸浆漂白、纺织品生物整理和生物燃料电池等方面都有潜在的应用。值得注意的是，漆酶具有在官能团的氧化与将异源分子连接到新的抗生素衍生物之间执行快速精密的转化的功能，或者催化合成复杂天然产物的关键步骤，因此可用于有机合成领域。 1 漆酶的性质 1.1 生化特征 漆酶是含有四个铜原子并与三个氧化还原位点（T1，T2和T3）相结合的典型单体胞外酶。T1型Cu在氧化还原测试中呈现绿色，与还原性底物的氧化作用有关。三核簇（含有一个T2型Cu和两个T3型Cu）与T1位点相距12 ?，分子氧在此处被还原成水。 在不同的培养条件下，真菌合成漆酶会出现不同的同工酶。大多数漆酶都是单体蛋白，不同来源的漆酶其分子被不同程度的糖基化，平均分子量在60-70kDa，碳水化合物含量在10-20%，这有助于漆酶的高稳定性。通常与酶通过共价键相连的碳水化合物包括甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖。氨基酸链含有包括N-末端分泌肽在内大约含有520-550个氨基酸。 1.2 生物学功能与工业应用 漆酶生物学功能包括孢子抗病性，色素沉着，选择性的催化木质素降解，腐殖质脱毒过程等。漆酶具有广泛的底物专一性，因此广泛应用与生物技术中。在小分子介质存在的情况下，漆酶能显著增强其底物专一性。通过使用漆酶介体体系可能扩宽漆酶工业应用的范围。例如，漆酶和漆酶介体体系已经应用于纸浆造纸中的脱木质素和生物漂白，发电站废水处理，纺织和染印工业中纤维素酶学修饰和染料漂白，酶法交联木质素材料生产中密度纤维板等。 在有机合成中，漆酶广泛用于官能团的氧化，酚类和甾类化合物的耦合，碳-氮键的构建以及复杂天然产物的合成中。 2 漆酶介体体系 漆酶与小分子如ABTS和HBT的结合不仅会具有更强的催化氧化还原能力，而且会扩大漆酶对底物的作用范围，并能够氧化氧化还原势能比其更高的化合物。此外，小分子介质作为电子载体，能够氧化木质素，纤维素或淀粉等生物高分子。由于氧化还原介质的作用，克服了阻碍酶与多聚物间的直接影响的空间结构的影响。 漆酶介体体系给生物技术和环境应用带来较高的效率。选择合适的介质在生物转化应用中是至关重要的。由于漆酶介体体系中底物通过不同的机制发生氧化，因此使用相同的前体时，不同介质的选择可能导致不同的终产物。介体自由基根据化合物的结构和有效的氧化还原势能执行具体的氧化反应。 尽管漆酶介体体系有较大的优势，但是以下两点阻碍了介质的使用:介体价格昂贵并会产生有毒的衍生物。在某些情况下，由于介质自由基的存在，漆酶在氧化介质时是不显示活性的。或者后者转化为无活性的化合物并失去充当介质的能力。因此寻找一种廉价高效、应用面广的介体将是LMS系统处理技术得以推广应用的关键。研究表明，一些真菌能自然合成天然的介体。例如苯酚，苯胺，4-对羟甲基苯甲酸，4-羟基苯甲基醇。最近，人们证明来自木质素降解过程中的酚类化合物（如乙酰丁香酮，丁香醛，香草醛，香草乙酮，阿魏酸，p-香豆酸）在染料脱色，多环芳烃的去除，纸浆漂白和沥青的去除中是高效的漆酶天然介体。 3 漆酶工程 迄今为止，很少有报道关于活性漆酶的晶体结构。根据已报道的漆酶结构，过去十年研究对具有催化活性的铜离子周围一些残基进行定点突变，以确定催化活性参数和真菌漆酶势能。收集在T1铜原子中心发生结构混乱的突变体是这些结构功能综合研究的结果之一。 在没有足够结构信息的情况下，分子定向进化能克服许多合理设计中的限制因素，并能显著增强有针对性的特征，例如耐高温和有机溶剂，提高催化活性及专一性等。Arnold等首次成功定向漆酶进化，通过定向进化在毕赤酵母中完成了耐热性漆酶的功能性表达：经过10轮实验室进化和筛选，总体酶活提高了170倍并具有更好的耐热性。 大多数漆酶在有机合成中催化转化必须发生在有机溶剂中。漆酶在高浓度有机助溶剂中会失去活性。Adinarayana Kunamneni等经过5轮定向进化在毕赤酵母中表达出一种耐热性漆酶，并能耐高浓度的有机助溶剂。这种进化的漆酶突变体能够抵抗大量与生物技术有关的浓度高达50%的可溶性助溶剂。固有的电化学漆酶特性如T1位和T2/T3位处的氧化还原势能，催化铜