发酵工程的研究状w况和进展.pptVIP

* 氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析 缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，柠檬酸循环不完全 无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，不能通过糖异生生产C6 G.oxydans基因组含编码氧化戊糖磷酸途径和D途径的全部酶基因 缺失编码磷酸果糖激酶的基因，糖酵解途径不完全 * 蛋白质组学 小菌单独发酵时胞内蛋白表达 大菌存在时小菌胞内蛋白表达 功能蛋白确定，研究大菌影响小菌产酸的机制 K. Vulgar B. megaterium * 发酵优化 明确大菌调控小菌的作用方式 阐释大小菌之间的功能关系 发展调控小菌生理功能的策略 提高糖酸转化率 提高VC产量 提高生产强度 基因测序 功能蛋白 产物解析 3-磷酸甘油醛 丙酮酸 葡萄糖 TCA循环 大菌特定的代谢途径 L-山梨酮 2-酮基-L-古龙酸 L-山梨糖 2-酮基-L-古龙酸生产途径 Vc 目标1：确定微生物之间的功能关系，提高效能 目标2：构建Vc一步发酵菌株，实现重大创新 举例2：维生素C发酵微生物的功能优化与调控 * 棉织物化学前处理工艺 Singeing Desizing Scouring Bleaching 退浆 淀粉、PVA 精练 角质、果胶 漂白 H2O2 化学品/高温 化学品/高温 化学品/高温 四种酶发酵与应用的系统控制优化 效果： 提高质量 节省能源 减少排放 国内外：加酶处理工艺 本课题：全生物处理工艺 效益： 发酵产值5亿 节能能耗15亿 环境效益30亿 举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术 Singeing Desizing Scouring Bleaching 退浆 淀粉、PVA 精练 角质、果胶 漂白 H2O2 淀粉酶/PVA酶 角质酶/果胶酶 过氧化氢酶 棉织物生物前处理工艺 * 高产菌株选育 产酶微生物筛选 菌株鉴定和遗传改造 分子克隆和工程菌构建 发酵过程研究 酶的分离与纯化 培养基和条件确定 发酵过程优化策略 过程放大和工业化 分段控制 流加发酵 低成本 放大技术 分离与纯化方法 酶的基本性质 工业化提取技术 诱导胁迫 举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术 * 酶制剂应用 酶应用特性和作用机理 复合酶和酶组分复配 过程模拟和最佳条件 应用效果评价 应用效果比较研究 经济学评价 环境效益分析 举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术 * 野生菌筛选与发酵 提取高纯度天然蛋白 电泳 主要斑点N端测序 或肽指纹术分析 N端序列/肽段分 子量数据库查询 获得基因 N端测序 设计核苷酸探针杂交 获得基因 生物数据库查询 同源序列 保守序列分析 设计引物扩增 相关序列片断 获得基因 若出发菌基因组序列为已知 若出发菌基因组序列未知 Thermobifida fusca 角质酶 角质酶高产菌的构建 细菌来源角质酶编码基因目前在国内外未有报道 酶制剂基因鉴定流程 举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术 * Purification step Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification fold Yield (%) Crude enzyme 234.9 12294 52.34 1 100 (NH4)2SO4 fractionation 46.4 5205.2 112.18 2.14 42.34 Phenyl HP Sepharose FF 4.75 1521.24 320.26 6.12 12.37 DEAE Sepharose FF 2.86 1140.91 398.60 7.61 9.28 Table I Summary of purification of wild-type cutinase from T. fusca 天然嗜热子囊菌角质酶的纯化 通过硫酸铵沉淀、疏水色谱、阴离子交换色谱从嗜热子囊菌发酵液中分离纯化得到电泳纯天然角质酶 角质酶高产菌的构建 举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术 * 肽指纹图谱鉴定角质酶基因 对电泳纯天然角质酶进行肽指纹图谱分析，通过数据库比对，得到角质酶的编码基因(Tfu_0883) 角质酶高产菌的构建 举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术 * Tfu_0883的克隆、表达和纯化 通过基因工程手段使角质酶基因在大肠杆菌中高效表达，工程菌发酵液酶活达180 U/mL，是野生菌产酶的9.4倍。 重组 Tfu0883具有角质酶活性 ? pET-20b(+), pelB as signal peptide, C-terminal His-tag ? E. coli BL21(DE3)Rossetta ? Ammonia sulfate prec