基因工程细胞工程专题复习.doc

基因工程 基因工程的基本工具 用来切割目的基因和载体的工具：限制性核算内切酶。可是DNA分子中某特定核苷酸序列的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子靠DNA连接酶完成。根据来源不同分为：E·coliDNA连接酶：连接黏性末端；T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端 将目的基因送入受体细胞的载体有：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 2．基因工程的操作程序 (1)目的基因的获取 ①从基因文库中获取。 ②利用PCR技术扩增： PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。 ③人工化学方法合成 ： 已知mRNA序列，利用反转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下，合成双链DNA分子； 已知蛋白质的功能根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。 (2)基因表达载体的构建（基因工程的核心） ①基因表达载体的构建方法 用同种限制酶切割目的基因和载体的目的：让切割得到的目的基因和载体含有相同的粘性末端。 ②基因表达载体的组成： 目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。 启动子：位于基因的首段，是RNA聚合酶识别和结合的部位。 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 （3）将目的基因导入受体细胞 导入植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 导入动物细胞：显微注射技术 导入微生物：感受态细胞法（Ga2+处理法） Ga2+处理大肠杆菌的目的：使细胞处于感受态，更容易吸收周围环境中的外源DNA分子 (4)目的基因的检测与鉴定 1）检测目的基因是否进入受体细胞：DNA分子杂交(DNA和DNA之间) 2）检测目的基因是否转录出：分子杂交技术(DNA和mRNA之间) 3）检测目的基因是否翻译出蛋白质：抗原—抗体杂交 细胞工程 植物组织培养技术 原理：离体植物细胞通过脱分化形成愈伤组织，通过再分化形成具有根和芽的试管幼苗或胚状体，再通过细胞分裂、分化发育成一个完整的植株。该技术称为植物组织培养，其原理为植物细胞的全能性。 已分化的细胞仍具有发育成完整植株的潜能，是因为：细胞内含有本物种全部的遗传信息。 细胞全能性表达的条件：完整细胞核、离体、无菌、一定的营养、激素和其他适宜的外界条件。 全能性大小：植物细胞：受精卵生殖细胞体细胞。 动物细胞：受精卵生殖细胞胚胎干细胞体细胞核(动物细胞全 能性受限制，但细胞核具有全能性)。 （4）培养基的成分为水、无机盐、维生素、氨基酸、蔗糖、植物激素(生长素和细胞分裂素等)等；培养基要求进行严格的灭菌。 （5）通过植物组织培养技术进行繁殖的方式属于无性繁殖 植物体细胞杂交技术 如图，植物细胞A和植物细胞B在进行杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得具有活力的原生质体。 原生质体A和原生质体B的融合必须要进行人工诱导。人工诱导方法有两大类：物理方法（离心、震动、电击等）和化学方法（聚乙二醇） 原生质体完成融合的标志：再生出新的细胞壁。 植物体细胞杂交包含植物细胞融合和杂种细胞的植物组织培养两个过程。其最终结果是形成杂种植株，因此其原理是：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。 植物体细胞杂交的意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍 3、动物细胞培养 动物细胞培养的特殊条件归纳 (1)胰蛋白酶的使用： 首先用胰蛋白酶处理动物的器官或组织，以制备单细胞悬液；悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养过程中细胞铺满瓶壁、细胞表面相互接触时就会停止生长， 出现接触抑制现象，此时，同样需要用胰蛋白酶使细胞分散开。 (2)避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理；加入一定量的抗生素；定期更换培养液。 (3)特殊的营养条件： ①液体培养基。②加入动物血清、血浆等。 （血清含促细胞生长因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖。） ③通入氧气以满足代谢的需要。④通入二氧化碳以维持培养液的pH。 动物细胞核移植和克隆动物 原理：细胞核移植技术形成重组细胞并发育成一个新个体，体现了动物细胞核的全能性和细胞膜的流动性。而非动物细胞的全能性。 种类：动物细胞核移植技术可分为胚胎细胞核移植技术和体细胞核移植技术，前者比较容易。 （3）克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。 （因为控制生物性状的遗传物质主要分布在细胞核中。） 材料： 供体细胞：发育良好的动物胚胎细胞或