基因工程实验报告.docx

基因工程实验报告、小麦GAPDH截短体的重组与表达摘 要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程（/view/1304451.htmgenetic?engineering）又称/view/8563.htm基因拼接技术和/view/97035.htmDNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入/view/3965127.htm受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——/subview/758htmDNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的/view/212514.htm工具酶进行切割后，把它与作为载体的/view/1468288.htmDNA分子连接起来，然后与/subview/184171htm载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了/view/152218.htm远缘杂交的不亲和障碍。实验过程实验部分流程： 小麦幼苗小麦总RNA的提取RT-PCR扩增小麦GAPDH基因pGEX-4T-1质粒提取表达载体的构建表达菌株转化目的蛋白诱导表达目的蛋白Western 杂交检测 2．小麦总RNA提取（Trizol法）2.1 材料小麦幼苗2.2 试剂配制及器具处理① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的/search?word=玻璃瓶fr=qb_search_expie=utf8玻璃瓶（180℃×2h）装/search?word=蒸馏水fr=qb_search_expie=utf8蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。④Trizol⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。⑥氯仿(最好用新的)。⑦异丙醇(最好用新的)。2.3 操作步骤：①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。⑤重复步骤④。⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。3. RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1 试剂① RNA模板②Olig（dT）18③反转录缓冲液④dNTP⑤ M-MULV反转录酶⑥ RNA抑制剂（RNasin）⑦Premix EX Taq DNA聚合酶⑧ PCR特异引物3.2操作步骤：3.2.1 RNA的反转录采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitTotal RNA6μL（需加入RNA约1μg）OligodT primer1μLH2O（nuclease-free）5μL12μL65℃ 5min，补加下列试剂：5× Reaction buffer4μLRibolockRNase Inhibitor1μL10mM dNTP Mix2μLRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase1μL20μL42℃ 60min70℃，5min，﹣20℃保