基因工程的基本操作程序2--公开课.pptVIP

导入 接种培养 含有四环素的完全培养基 死亡 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 接种培养 含有氨苄青霉素的完全培养基 存活 * 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）方法：Ca2+处理法（增加细胞膜通透性） （2）微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 （3）过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 四、目的基因的检测与鉴定 检测（分子水平）: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 个体生物学水平鉴定 （1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 A 方法: DNA分子杂交 B 过程: 1.检测 　 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。 (2)检测目的基因是否转录出了mRNA ①方法: 分子杂交法 ②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法: 抗原-抗体杂交 提取 方法——抗原-抗体杂交 苏云金杆菌 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分化 组织培养 2.鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 目的基因的表达和检测 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 抗原－抗体杂交法 DNA-RNA分子杂交法 DNA分子杂交法 受体是否具有 转基因特征 个体水平 目的基因是否翻译 目的基因是否转录 目的基因是否插入转基因生物的染色体 分子水平 方法 检测对象 非编码区 非编码区 编码区 外显子 内含子 终止子 基因的结构 启动子 原核 真核 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 连续 不连续 编码区 非编码 编码区 非编码区 非编码区 mRNA前体 mRNA 单链DNA cDNA 转录 剪接 逆转录 复制 启动子 终止子 基因 不含非编码系列。即不含非编码区和内含子 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 ③过程： a、变性（90℃-95℃）：双链DNA在受热下，_____断裂，形成________ b、复性（55℃-65℃）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 ④方式：以_____方式扩增，即____ ⑤条件：前提条件:________________ ⑥ 结果： 指数 2n 短时间内大量扩增目的基因 已知基因的核苷酸序列 DNA复制 PCR技术 场所 解旋方式 酶 PCR技术扩增与DNA复制的比较 高温 解旋酶 体外复制 主要在细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 （3）人工合成法： 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成 化学合成法 、 反转录法 蛋白质 mRNA DNA 推测 推测 DNA DNA合成仪合成 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 生物某个发育时期的mRNA 单链DNA 双链cDNA片段 重组DNA 与载体连接 cDNA文库 反转录酶 DNA聚合酶 导入受体菌中储存 ② cDNA文库的构建-----逆转录法： 目的基因所在片段 运载体 PStⅠ DNA连接酶 重组DNA 运载体自连 目的基因 自连 CTTAA G CTTAA G CTTAA CTTAA G G PSt Ⅰ 运载体的特点3： 有标记基因 导入 接种培养 接种培养 接种培养 接种培养 含有四环素的完全培养基 完全培养基 大肠杆菌不含抗四环素基因 证明： 不存活 含有四环素的完全培养基 证明： 大肠杆菌含抗四环素基因 证明： 大肠杆菌的受体细胞含有目的基