第三章蛋白质一级结构及测定.ppt

蛋白质化学测序 ③Cleland试剂的还原作用 Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试剂，只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原，反应基本与疏基乙醇相似，且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂。 (二)封闭N—末端的测定 1.乙酰化N—末端：CH3CO-NH- 肼解 N—末端乙酰基形成乙酰肼，与DNS—Cl作用，形成N—乙酰—N′—丹磺酰肼，经乙醚抽提后，层折鉴定。 从编码蛋白质的核酸序列推测氨基酸序列★ 测定蛋白质序列和测定核苷酸序列的技术是互补的。获取基因后，DNA测序要比蛋白质测序快得多，现在大多数蛋白质是直接通过这种方法来获得序列的； 十二烷基磺酸钠(  实际是测定几个不同浓度的渗透压，以  对C作图，并外推到蛋白质浓度为0时，得截距，即 ，代入上式 六、根据氨基酸残基数估算分子量 氨基酸的平均分子量为138，由于小分子量氨基酸较多，故以128计 ，又由于形成肽键，而每个氨基酸残基的平均分子量可按110估算。 /tools/mwcal/MyMW.asp 第三节 质谱法研究蛋白质 质谱法： 将被分析的分子（分析物）先在一个真空室中离子化，当新带上电的分子被引入电场或磁场时，它们在场中走过的路径是一个质量电荷比m/z的函数。不同电离离子的这一特性是可测知的，并用于推到分析物的精确质量。 MALDI MS（基质辅助激光解析/电离质谱, matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry) 将蛋白质置于光吸收介质中，在短脉冲激光作用下电离，并从介质中被吸收入真空管。 ESI MS (电喷雾电离质谱, electrospray ionization mass spectromerty) 蛋白质溶液通过高压电针，弥散成带电液滴形成的细雾。周围的溶剂分子很快蒸发，结果带电大分子被完整无损地引入气相。在穿过电针时加入的质子使大分子带上了额外的电荷。分子的m/z 可在真空室中进行分析。 蛋白质溶液通过加高压的针管喷出形成带点液滴。液滴蒸发，带点离子（附加氢离子）进入质谱仪测量m/z。 产生的质谱是一簇峰，其中从右到左排列的峰对应带点离子质量和电荷每增加一个单位。 串联质谱测定但蛋白质序列信息 第四节 小肽及蛋白质的化学合成 许多小肽是潜在的药物，作为产品有相当的商业价值。有3种获得肽的途径： ①从组织纯化，但常常由于肽浓度较低而使纯化困难； ②利用基因工程获得； ③直接化学合成。? 保护基团9－氟甲基羰基（Fmoc）封闭α-氨基上不需要的反应。 肽合成过程中每步产率对总产率的影响 第五节 物种间的蛋白质同源性 同源蛋白质（homologous protein）：进化上相关的一组蛋白质。它们在不同物种中行使着相同功能，如细胞色素Ｃ。 不同物种的同源蛋白质是长度相同或相近多肽链。氨基酸序列的许多位置在所有物种中被同样的残基占据，这些残基叫做不变残基（invariant residue)；而另一些位置则表现出相当的可变性，这些残基称为可变残基（variable residue）。 五、超离心沉降速度法 Svedberg公式： M——分子量； T——绝对温度； S——沉降系数，即单位离心力场中的沉降速度，1S＝10-13秒； R——气体常数(8.314×107尔格/摩尔浓度)； D——扩散系数，当浓度梯度为每厘米一单位时，一秒钟通过1cm2面积所扩散的溶质量，可用实验求得； V——溶质的偏微比容，是当1g溶质加到无限大体积溶剂中时，液体体积的增量。可在不同浓度下测得溶入溶质后的体积增量，用外推法求得无限稀释时的值，即V； ρ——介质密度(溶剂) 可根据S、D、V计算分子量，S根据沉降速度和离心力求得。 界面移动的速度 即沉降速度，分 子量愈大，界面 移动愈快，若 溶液中有几种 蛋白质分子就会出现几个界面，可借助适当的光学系统，观察界面的移动。 二环己基碳二亚胺 100 51 31 21 11 最终合成的多肽含有的氨基酸残基数 82 1.