第四章菌种的选育和保存.ppt

2、生产车间种子制备 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，在罐中繁殖成大量菌丝的过程。 （1）种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： 菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； 所采用发酵罐的容积 如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27?C,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（ 27?C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 确定种子罐级数需注意的问题 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 （2）接种龄与接种量 种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。 不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。 接种量 接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。在抗生素工业生产中，大多数抗生素发酵的最适接种量为7％~18％，有时可增加到20％~28％。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。 近年来，生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。 双种法，采用二只种子罐接一只发酵罐。 倒种法，即以适宜的发酵液倒出适量给另一发酵罐作种子。 三、 种子质量的影响因素与控制 （一）影响因素 1、原材料质量 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。 例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。 2、培养条件 （1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37?C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子斜面的培养温度。 （2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。 （3）通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。 3、培养时间和冷藏时间 （1）培养时间 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。 （2）冷藏时间 斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4?C冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6? C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。 （二）控制措施 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。 菌种稳定性的检查 无（杂菌）检查 第二章 思考题 1、菌种选育的基本原理及主要方法有哪些？ 2、菌种保藏的主要方法有哪些？ 3、种子制备具体有哪三个过程？ * 例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%~45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。 如氯霉素的生物合成过程中，芳基胺合成酶为关键酶，当氯霉素浓度到达100u/ml时，可完全抑制该酶的合成。因此，可以考虑选育解除终端产物反馈调节的突变株。 类似还有：新生霉素影响产生菌的琥珀酸脱氢酶活力、制霉菌素影响醛缩酶活力，瑞斯托霉素影响磷酸甘油醛脱氢酶活力等。 在青霉素发酵过程中加入苯乙酸或苯氧乙酸作为前体，分别能合成青霉素G和V。但培养基中过量的前体有较强毒