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基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用The Current Status of Gene Knockout and its Application in Metabolic Engineering天津大学化工学院二零壹六年六月摘 要基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。关键词： 基因敲除 代谢工程 同源重组 CRISPR/Cas9 ABSTRACTGene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, homologous recombination, CRISPR/Cas9目 录第一章 基因敲除技术11.1基因敲除相关背景11.2基因敲除技术在代谢工程中的应用2第二章 基因敲除策略32.1传统的基因敲除策略32.1.1利用同源重组进行基因敲除32.1.2利用随机插入突变进行基因敲除42.2新兴的基因敲除策略52.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除52.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术52.2.3 TALENs 靶向基因敲除技术62.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术7第三章 前景展望9参考文献10致谢11第一章 基因敲除技术1.1基因敲除相关背景随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。现阶段基因功能的研究主要是通过减弱或中止某一基因表达，观察生物体整体功能变化，推测该基因的相关功能，然后将基因与生物整体功能相关联进行深入探究，为最终确定基因功能提供依据[1]。随着功能基因组学研究的深入，相关技术也得到不断地发展与完善，其中最为常用的便是基因敲除技术。基因敲除是20世纪80年代末发展起来的一门新技术，2007年获得诺贝尔生理或医学奖[1]。该技术是以DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础， 经过30余年的发展，现今已经有多种基因敲除技术被应用于分子生物学、遗传学等诸多领域[2]。而近年来新兴起了ZFNs、TALENS、Cas9等多种基因高效靶向修饰和调控技术。2012年1月基因组编辑核酸酶技术的Nature Methods杂志评选为年度研究方法[3]。2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一[4]。这些技术极大地提高了基因敲除的效率，且具有极高的特异性，为研究基因功能创造了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展。基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除[5]。现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用最为广泛。基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。然而，基因敲除也有其无法克服的缺点和不足：1）在敲除过程中，被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区，残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能，这将给表型分析带来麻烦；2） 敲除掉某个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因在于许多基因在功能上是冗余的，敲除掉一个在功能上冗