第二节荧光抗体技术-科学网—群组.doc

第二节 荧光抗体技术 一、荧光抗体的制备 （一）抗体的荧光素标记 用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取igg后再作标记。作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。⑤标记方法简单、安全无毒。⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。以fitc标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/lph9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入fitc溶液，在室温持续搅拌4～6h后，离心，上清即为标记物。此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短，荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。 透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含fitc的0.01mol/lph9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对pbs透析法去除游离色素。低速离心，取上清。 标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。纯化方法可采用透析法或层析分离法。 （二）荧光抗体的鉴定 荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至a2801≈1.0，分别测读a280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。 按公式计算。 f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。 抗体工作浓度的确定方法类似elisa间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:4～1:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。 荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，－20℃冻存，这样就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。 二、免疫荧光显微技术 免疫荧显微技术的基本原理是：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。 （一）标本的制作 荧光显微技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位。因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。 常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。按不同标本可制作涂片、印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。石蜡切片因操作烦琐，结果不稳定，非特异反应强等已少应用。组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上1～2层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。涂片或印片制成后应迅速吹干、封装。置－10℃保存或立即使用。 （二）荧光抗体染色 于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般可用25～37℃30min，不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜。用pbs充分洗涤，干燥。 （三）荧光显微镜检查 经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。 荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。首先要选择好光源或滤光片。滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。在光源前面的一组激发滤光片，其作用是提供合适的激发光。激发滤光片有两种。mg为紫外光滤片，只允许波长275～400nm的紫外光通过，最大透光度在365nm；bg为蓝紫外光滤片，只允许波长325～500nm的蓝外光通过，最大透光度为410nm。靠近目镜的一组阻挡滤光片（又称吸收滤光片或抑制滤光片）的作用是滤除激发光，只允许荧光通过。透光范围为410～650nm，代号有og（橙黄色）和gg（淡绿黄色）两种。观察fitc标记物可选用激发滤光片bg12，配以吸收滤光片og4或gg9。观察rb200标记物时，可选用bg12与og5配合。 （四）实验的类型 1．直接法用特异荧光抗体直接