蛋白含量(owry法)测定标准操作规程.docVIP

细胞因子蛋白含量（Lowry法）测定标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于细胞因子原液的检定。 目的：检测细胞因子原液的蛋白质含量。 原理： lowry法是在双缩脲反应的基础上发展起来的。是由试剂A和试剂B二部分组成。试剂A是碱性铜试剂；试剂B含有磷钨酸和磷钼酸。在碱性条件下，蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色的蛋白质与铜的复合物，然后此复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原试剂B中的磷钼酸-磷钨酸，产生深兰色，为钼兰和钨兰的混合物，其呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，可用比色法测定蛋白质浓度。 内容： 1 材料 1．1样品：经二人核对好批号后测定。 1．2试剂 钨酸钠 Na2WO4·2H2O 化学纯 钼酸钠 Na2MOO4·2H2O 分析纯 磷酸 H3PO4 分析纯 浓盐酸 HCl 分析纯 硫酸锂 Li2SO4 分析纯 酒石酸钾钠 C4H4O6KNa·4H2O 分析纯 硫酸铜 CuSO4 分析纯 氢氧化钠 NaOH 分析纯 无水碳酸钠 Na2CO3 分析纯 溴水 Br2 分析纯 1．3标准品：由中国药品生物制品检定所提供。 1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。 1．5其它材料：试管架、吸球、硫酸纸、药勺、记号笔、玻璃比色杯。 1．6仪器、设备 紫外分光光度仪,UV-265 扭力天平，TN100B 冰箱，BOD-170A 1．7器皿 试管、量筒（250ml、100ml）、玻璃瓶（500ml、250ml）、棕色磨口瓶（50ml、500ml）、吸管（1ml、5ml、10ml），以上均由本室洗刷组处理干净。 2 方法 2．1准备工作 2．1．1工作环境：控制区确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。 2．1．2调试仪器设备 2．1．2．1紫外分光光度仪，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。 2．1．2．2扭力天平，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。 2．1．2．3冰箱，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。 2．1．3试剂配制 2． 1． 3．1试剂A：用扭力天平准确称取20克Na2CO3溶于500ml 0.2mol/L NaOH溶液中，另将1克CuSO4·5H2O溶于100ml 2%酒石酸钾钠溶液中，临用前将二种溶液按50：1的比例在250ml洁清的玻璃瓶中混合均匀，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期。放置30分钟，即为试剂A。 2．1．3．2试剂B：在2升磨口回流蒸馏器中，向烧瓶中加入钨酸钠（Na2NO4·2H2O）100克，钼酸钠（NaMO4·2H2O）25克 ，蒸馏水700ml，85%磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混匀后接通回流凝管，沸腾后文火回流10小时，冷却后加硫酸锂150克，蒸馏水50ml及数滴溴水，摇匀，取下回流冷凝管，开口继续沸腾15分钟，以驱走过量的溴，此时溶液为金黄色，冷却后用蒸馏水定容至1000ml放棕色瓶中4℃冰箱保存，回流整个过程应在通风橱中进行，使用时2倍稀释。二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。 2．1．3．3 0.2M NaOH：用扭力天平准确称取NaOH 0.8克，加注射用水至100ml，配好后的液体放250ml洁净的玻璃瓶中，盖上胶栓，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，室温备用。 2．1．3．4 2%酒石酸钾钠：用扭力天平准确称取酒石醋酸钾钠2克，加注射用水至100ml，配好后的液体放入250ml洁净的玻璃瓶中，盖上胶栓，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，放4℃冰箱备用。 2．2具体操作步骤 2．2．1摘下设备上的“备用”标志，挂上“运行”标志，设备的详细操作参见设备标准操作规程。 2．2．2取洁净干燥的试管若干，分成二组按下表进行操作。 表1 试管编号 处 理 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 标准溶液（ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0