4生物技术制药DNA重组技术6w.pptVIP

（2）通过PCR获得目的基因 ＤＮＡ分子的体外连接目标DNA片断插入载体 ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。 ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： 　 (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 　 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。 Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 Ｔ４连接酶作用分三步： １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ复合物。 ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。 ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来. 连接反应的检测 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 电泳检查连接结果 质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关。 获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两种假说： 局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。 现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步 吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； 转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链； 表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。 这和受体菌、质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； ２．根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法： 抗生素筛选法 互补法 抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 4、目的基因的检测和鉴定 A、转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因—DNA分子杂交法 B、目的基因是否转录出mRNA—RNA分子杂交法 C、目的基因是否翻译成蛋白质—蛋白质分子杂交 （1）转基因动植物目的基因的检测和鉴定 分子杂交技术 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNA DNA （一）印迹技术 （二）探针技术 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 三种印迹技术的比较 分子杂交实验 ① ② ③ 放射自显影照片 DNA点阵 （2）转基因细菌中目的基因的检测和鉴定 * * 基因工程制药的基本方法 一、重组DNA技术 二、举例 第二节 重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技术 克隆(clone)---无性繁殖 分子克隆– DNA的无性繁殖技术 重组DNA技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 一、重组DNA技术 重组DNA操作一般步骤 （1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子—表达载体； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 获得目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库，从中调用目的基因； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段； （4）化学合成 1. 获得目的基因（外源基因） 限制性内切酶 反转录 基因文库 基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library) （1）从基因文库中调用目的基因 基因文库 供体核酸分离的一般程序 供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA