复杂性疾病的分子诊断525-12am.ppt

1. 点突变的诊断 一、限制性酶切图谱直接分析法 导致某一限制酶识别位点 移位的大片段缺失或插入， 导致某一限制酶识别位点 丧失或获得的点突变， 均可引起相应限制性片段 的长度和数量发生变化。 分析限制性酶切图，即可 诊断出此类突变。 二、ASO探针杂交 受检者基因组DNA或含 突变位点的PCR扩增产物 与标记的ASO 探针杂交 2.片段性突变的检测 杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断 将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传标志，在同一个家系成员中探查是否存在致病基因的方法即为基因连锁分析法。 DNA多态（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。 它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。 常用的遗传性多态性标记有3类： 1）RFLP： 称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 2）重复序列多态性（VNTR）： 如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记； 3）单核苷酸多态性（SNP） DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。 1 Southern blot--RFLP诊断(PKU) PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，以PAH cDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。 患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH 基因与19kb片段连锁 其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁， 其23kb片段与正常PAH基因连锁。 II2为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。 数目变异串联重复variable number tandem repeats, VNTR 重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即 VNTR。 散在分布于染色体上。 重复单位6~25bp长，称为小卫星DNA。重复单位2~6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA，又称短串联重复序列(STR) 。 Examples of microsatellite CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA (CA)24 AATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGA ATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAA TGAATGAATGAATG (AATG)28 VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。 DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP） VNTR 酶切，电泳后的检测结果 成年型多囊肾病的诊断 例：成年型多囊肾病——APKD，AD ，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。 APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过VNTR连锁分析进行诊断。 PCR-VNTR检测 PCR-VNTR 基因诊断在遗传性疾病中的应用 遗传性疾病的主要分子机理是基因突变，因而是基因诊断的最佳适应症。用分子生物学技术直接检测病原体，可对感染性疾病特异、快速地作出早期诊断。 一、 遗传性疾病 血红蛋白病 最早成功进行产前基因诊断 1）异常血红蛋白病 珠蛋白基因突变（单硷基替代、缺失或插入等） 镰状细胞贫血： b-珠蛋白基因第6位密码子GAG→GTG (E6V) 该突变使限制酶MstII位点消失(CCTGAGG→CCTGTGG) 诊断方法： 限制性酶切图谱直接分析法 (基因组DNA或PCR产物) ASO 斑点印迹杂交分析法