第4章污染物的生物效应新建 Microsoft PowerPoint 演示文稿.ppt

第三节 生物的分子和细胞水平检测 一、加合物测定 加合物的研究意义 据统计, 人类每年合成数以千计的新化合物并排放到环境之中, 这些化合物许多具有遗传毒性。如何对这些化学物质进行监测和评价是一项十分艰难而重要的工作。 检测周围媒体(大气、水、土壤等) 中化合物含量水平来评价有毒物和人体健康之间的关系是不够的, 因为这种外剂量的评价方法只能给出生物体可能接受的大概剂量, 而不能给出一定的信息来说明生物体对毒物的吸收、代谢、生物效应等的差异。 随着研究的深入, 人们提出应用大分子(蛋白质、RNA、DNA )加合物来研究和评价具有遗传毒性的化学物质致癌风险性。 它们不仅能反映化学物质及其代谢产物在组织或体液中的剂量, 而且能够提供实际到达的作用部位或与关键的细胞大分子反应的确切剂量； （一）DNA—加合物的测定 DNA 加合物就是亲电性的化合物或其代谢产物和生物体内大分子形成共价相连的化合物, 是DNA化学损伤的最重要和最普遍的形式。 这种加合物一旦逃避自身的修复, 就可能成为致突、致畸、致癌的最小因子, 因此DNA 加合物的形成被认为是致肿瘤过程的一个重要起始阶段。 研究表明DNA 加合物的形成与肿瘤的发生、发展之间存在着因果联系和剂量一反应关系。 　DNA 加合物的形成机制 DNA 呈双链超螺旋结构存在于细胞中, 嘌呤和嘧啶碱基重于螺旋内侧。在DNA 的4 个碱基中, 存在着N、O、P等原子, 这些原子都含有孤对电子, 容易受到亲电试剂的攻击。 研究表明, 在DNA 分子至少有12个位点易受到化学致癌剂的攻击。 对于大多数致癌物都是经过代谢活化后变成亲电的代谢物后, 再与DNA 发生共价结合的, 但也有直接结合的化合物。 DNA加合物的测定：色谱-质谱法 　目前最常用的诊断、检测及定量分析加合物的方法： 原理是根据复杂样品中的各组分在流动相和固相间具有不同的分配系数,当两相作相对运动时,各组分便在两相中进行溶解、吸附、脱附的多次反复分配,达到彼此分离的结果. 这种色谱分离技术与适当的检测手段(如电化学检测器等) 相结合时,就构成了色谱分析法.当前最成熟的联用仪是色谱/ 质谱联用仪. 该法的优点是灵敏度高、特异性强、用于检测极微量加合物的存在及研究其形成机理. GC-MC 和LC-MC 在分析蛋白质加合物中有重要作用. 毛细管气相色谱与质谱联合分析是目前灵敏度最高的技术之一, 目前已研制出毛细管区带电泳分离与质谱联用技术,并被应用于加合物的诊断、分离和检测. DNA加合物的测定：32 P-后标记法 --为国际公认的最有发展前途的方法 Gupta 于1982 年就建立32 P 后标记法(32P-Postlabeling Assay) 来诊断、检测生物体中形成的DNA 加合物。 一种非常灵敏的诊断方法，灵敏度为1个DNA加合物/1×109～1×1010核苷酸。该法的基本原理是，与外源性物质形成加合物的单核甘酸,可抵制酸酶的降解,并被标记上32P ，从而通过放射性的定量分析诊断、检测所形成的DNA 加合物。 此法的优点是检测能力强所需DNA的样品量少, 非常适合只能提供少量DNA 的人体样本(几个微克) 的检测, 不需要事先制备加合物标样, 用空白对照可以定量计算加合物含量, 既可用于单一加合物的检测, 也可用于复杂混合物的测定及未知的内源性亲电性物质所形成的加合物的测定,应用范围广,可适用于检测不同类型的化学污染物,如PAH、芳香胺、烷基化物、不饱和醛类以及活性氧、紫外线辐射等所引发的DNA 加合物,尤其是可用于生态毒理学研究中生物样品的加合物测定以及判断化合物的生态毒性。 其缺点是特异性较差, 步骤比较多, 稳定性不易掌握, 不同的实验室所测定的结果差别很大。在定量水平上存在局限性，因此有必要同其它检测方法结合起来进行应用。 DNA加合物的测定：免疫学法 Sabtella等于1988 年创建了酶联免疫吸附测定法(ELISA) ,该方法用生物大分子加合物抗体(单克隆体或多克隆体) 来诊断、检测靶组织中的相应加合物及其含量,可以在特异的组织或细胞中进行定位研究. 其测定DNA加合物的灵敏度为1个DNA 加合物/ 1×107～1 ×108 核苷酸. 该方法的基本原理为抗原抗体反应,通常需要结合其它的富集、分离及检测加合物的方法来得出最佳测定效果. 其优点是费用低,简便易行,无须接触高水平的暴露量,适用于大量人群流行病学调查的研究; 其缺点为所需样本量大,抗体间存在交叉反应,对于非抗原性加合物和未知抗原的加合物不能进行检测. DNA加合物的测定：荧光测定法 原理是通过某些化合物(特别是多环芳烃) 的DNA 加合物具有荧光的特性来测定, 其检测限为1个加合物/106~108核苷酸,